细胞膜表达的HLA?G诱导免疫耐受性树突状细胞的产生
作者：周浩 黎纬明 张敏 刘峥嵘 邹萍
【摘要】 为了探讨体外诱导免疫耐受性树突状细胞(dendritic cell, DC)产生的方法及其机制，利用人HLA?G1真核表达载体转染K562细胞并与DC共培养后，用流式细胞术检测DC表面CD80、CD86、ILT3和ILT4分子表达情况，同时采用氚胸腺嘧啶核苷（3H?TdR）掺入法检测DC对T细胞功能的影响。结果表明，膜表达的HLA?G1分子与树突状细胞作用后，DC表面免疫共刺激分子CD80、CD86表达下调，而抑制性分子ILT3、ILT4表达上调。HLA?G1作用后DC异基因抗原诱导淋巴细胞增殖的活性明显下降。结论：HLA?G1分子可以在体外条件下，下调DC表面免疫共刺激分子水平，促进ILT3、ILT4表达，诱导免疫耐受性树突状细胞产生。
【关键词】 树突状细胞；HLA?G；T淋巴细胞；免疫耐受
Induction of Tolerogenic Dendritic Cells by Membrane?Bound HLA?G
Abstract In order to study how to induce tolerogenic dendritic cells in vitro and its mechanism, the K562 cells transduced with HLA?G construct were used to co?culture with DC. Then their related immunological changes, such as membrane molecules CD80, CD86, ILT3 and ILT4 expression levels were detected by flow cytometry. Allogeneic proliferation of peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) was detected by mixed lymphocyte reaction. The results showed that CD80 and CD86 expressions on DC were downregulated, while ILT3 and ILT4 expressions were upregulated after co?culturing with K562?HLA?G cells. The DCs were less able to stimulate the allogenic PBMNC. It is concluded that the membrane?bound HLA?G can upregulate expression of inhibitory receptors ILT3 and ILT4, inducing tolerogenic DC in vitro, which may provide a novel strategy for transplant tolerance induction.
Key words dendritic cell; HLA?G; T lymphocyte; immune tolerance
移植排斥所导致的移植物抗宿主病（GVHD）是骨髓移植领域的难题。目前临床免疫抑制剂的应用虽然可以显著降低急性GVHD的发生，但是慢性GVHD损害的发生仍然难以克服。诱导受者外周免疫耐受被认为可能成为解决移植后慢性GVHD的有效途径［1］。树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内功能最强的专业性抗原呈递细胞，是活化初始CD4+T细胞最有效的抗原呈递细胞。近年来，人们逐渐认识到DC在外周免疫耐受中的作用，并寻找诱导免疫耐受性树突状细胞产生的有效途径［2］。免疫耐受性树突状细胞膜上高表达ILT3和ILT4分子，它们的可能配体是HLA?G［3］。研究发现，HLA?G促进心脏移植后的外周免疫耐受状态的产生，其机制可能与诱导树突状细胞耐受有关［4］。本实验希望通过对HLA?G诱导DC免疫耐受的机制的研究，探讨诱导免疫耐受性DC产生的新的有效方法。
材料和方法
主要试剂、细胞株及HLA?G1 真核表达质粒
RPMI 1640培养液、DMEM培养液、G418、TRIZOL一步法提取RNA试剂及逆转录试剂盒均购于Gibco公司，Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒购于Invitrogen公司，小牛血清购于杭州四季青公司。慢性粒细胞白血病细胞株 K562、 绒毛膜癌细胞株JEG?3细胞来源于ATCC，培养于含15% 小牛血清的RPMI 1640 培养液中。 包括人HLA?G1全长cDNA的真核表达质粒由Carole Ober博士惠赠。
K562细胞的转染及药物筛选
脂质体介导的真核细胞转染技术参照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒说明进行。转染细胞在800 μg/ml浓度G418条件下筛选稳定株。稳定转染细胞株表示为K562?HLA?G1，转染空载体的细胞株表示为K562?RSV。
抗体和流式细胞术
小鼠抗人HLA?G1单克隆抗体(MEM?G/9) 购自BioVender公司。小鼠抗人HLA?DR、 CD1a、ILT3、ILT4、CD80、CD86抗体，PE标记小鼠抗人CD1a抗体均购自R&D公司。FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体、山羊抗小鼠IgG免疫磁珠购自晶美公司。流式细胞术分析前，将细胞与含20%人血清的PBS作用以封闭Fc受体。并用同型对照抗体以系统性消除非特异性结合。流式细胞分析采用CellQuest软件。
外周血来源树突状细胞培养及细胞的共培养
取新鲜的人肝素抗凝外周血20 ml，用PBS 以1∶1的比例稀释后沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，2 000×g离心20分钟后取白膜层细胞，用PBS以 1 500×g离心10分钟 洗涤2 次，并用RPMI 1640以 1 000×g离心10分钟，洗涤1次，最后用含10%(v/ v)胎牛血清RPMI 1640完全培养液重悬细胞，以2×106 cells/ml细胞浓度加到24 孔培养板中，每孔1 ml 。放置37 ℃、5 % CO2 孵箱内孵育2小时，吸弃细胞悬液，用RPMI 1640轻洗3 次洗去非黏附细胞,获得粘附细胞，分别按1×106 U/ L 、5×105 U/ L 终浓度加入细胞因子GM?CSF和IL?4。间日更换1/2体积培养液并加入相当首次浓度半量的细胞因子。倒置显微镜逐日观察细胞生长状况，培养7天收集未成熟树突状细胞（immature DC，iDC）。在iDC与K562?HLA?G1细胞共培养试验中，将iDC与K562?HLA?G1细胞分别以1×106 cells/mL和1×105 cells/ml混合培养48小时。通过小鼠抗人CD1a抗体和山羊抗小鼠免疫磁珠联合分离出混合培养体系中的树突状细胞。
混合淋巴细胞反应
以新鲜分离的另一健康志愿者来源的外周血单个核细胞（PBMNC）作为反应细胞。以K562细胞共同培养后的DC经过30 Gy γ射线灭活后作为刺激细胞，以104和105数量分别接种到96孔板，反应细胞以105数量接种，每次反应均设3个复孔。CO2孵箱培养5天，加3H?TdR，再培养12 小时后，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，干燥后用液闪法测定并刺激指数（SI）。
统计学处理
应用SPSS 11.0软件分析结果，组间数据比较用t检验，以P<0.05为具有统计学意义。
结 果
转染细胞的间接免疫荧光检测
将转染48小时后的K562细胞进行间接免疫荧光检测。转染HLA?G1的K562细胞显示出绿色荧光。证明所构建的HLA?G1真核表达载体可以在K562细胞上正确表达（图1A）。
转染细胞HLA?G1水平的流式细胞术检测
检测显示，转染空载体的K562细胞表面无HLA?G1表达，而HLA?G1?K562细胞表达HLA?G1，经过G418筛选后纯度超过98.2%。此结果说明已经成功建立稳定表达HLA?G1的K562细胞株（图1B）。
外周血来源树突状细胞鉴定
培养6天后可见较多形态不规则的悬浮细胞，数个细胞呈团状悬浮。普通光镜下见细胞有大量毛刺，符合树突状细胞的形态。流式细胞术分析树突状细胞表型，检测 MHCⅡ类分子（HLA?DR），结果显示细胞低表达HLA?DR （16.7%）、 CD1a （21.9%）、 CD80 （24.6%）、 CD86 （31.9%），此检测结果符合报道的不成熟树突状细胞表型（图2）。
Figure 2. Detection of membrane molecules on PBMNC?derived DCs.
外周血单个核细胞来源树突状细胞与K562?HLA?G1细胞共培养
分成3组， 第1组是未成熟树突状细胞单独培养；第2组是树突状细胞与K562?HLA?G1细胞共培养，第3组是树突状细胞与空载体K562?RSV细胞共培养。流式细胞术检测树突状细胞的表面分子表达，CD80，CD86分子表达水平下调（分别为15.7％与22.1％）（图3）。而免疫抑制性分子ILT3，ILT4表达水平上调（图4）。
Figure 3. CD80 and CD86 expression on DCs after co?culturing with K562?HLA-G1 cells for 48 hours.Figure 4. Expression of ILT3 and ILT4 on dendri? tic cells after co?culturing with K562?HLA?G1 cells for 48 hours.
HLA?G作用后的DC刺激T细胞增殖功能受到抑制
对照组中DC与K562?RSV共培养48小时之后，分选出DC再与同种异体来源的外周血单个核细胞（PBMNC）共同培养5天，DC表现出很强的促进PBMNC针对同种异基因抗原的增殖能力，而DC与K562?HLA?G1共培养48小时后， 其刺激PBMNC同种异基因抗原增殖的能力被抑制（图5）。
Figure 5. Proliferation of allogeneic PBMNC sti? mulated by DCs. 讨 论
树突状细胞被认为在维持机体免疫耐受中发挥重要作用。在中枢耐受形成过程中，胸腺树突状细胞通过呈递自身抗原，参与完成T细胞的阴性选择。最近研究发现，在外周耐受的形成和维持过程中，DC也起到了重要作用［2］。在心脏移植后的小鼠体内，发现有耐受性DC存在，它们发挥免疫抑制的作用，可以诱导抗原特异性的CD4+ CD25+T细胞和CD8+ CD28-T细胞产生，从而抑制下游免疫细胞活化级联反应，有利于外周免疫耐受的形成和维持。这群细胞具有特殊的免疫表型，即高表达免疫球蛋白样转录物（leukocyte immunoglobulin?like receptor）ILT3和ILT4［5］。
Takai等［6］通过研究发现，HLA?G是ILT3和ILT4的配体之一，HLA?G可以和细胞表面的ILT3，ILT4分子结合，并诱导树突状细胞成为调节性树突状细胞，发挥免疫抑制作用。人 ILT3/ILT4和小鼠同源物PIR?B是除T细胞受体TCR和杀伤细胞受体以外的第三种免疫细胞自体识别分子，在免疫应答负性调节和耐受形成中起重要作用。在小鼠体内的实验也发现，小鼠的树突状细胞与HLA?G四聚体分子作用后，细胞表面PIR?B分子表达水平上调。这种细胞表型的改变伴随有树突状细胞的功能改变，细胞也成为具有免疫抑制作用的调节性树突状细胞［7］。
HLA?G属于非经典的HLA?I类基因，基因表达产物HLA?G的主要分布于胎盘绒毛外细胞滋养层上，这种独特的组织分布分子提示HLA?G在母胎耐受方面起重要作用，因而引起研究者们的高度重视［8］。近年研究发现， HLA?G可能对机体的外周免疫发挥抑制作用，从而利于移植物逃逸宿主外周免疫细胞的杀伤［9］。可是对于HLA?G作用的靶分子以及靶细胞的作用机制都不是十分清楚。DC是外周免疫的“哨兵”，HLA?G诱导外周免疫的抑制可能发生在DC环节。
本实验通过将无MHCⅠ/Ⅱ类分子表达的K562细胞转染非经典MHC?Ⅰ类分子HLA?G，成功构建了稳定表达膜型HLA?G1的细胞模型。由于K562?HLA?G1细胞表面只有非经典的MHC?Ⅰ类分子HLA?G表达，而没有其它MHCⅠ和Ⅱ类分子，故可以方便地用于研究膜表达型HLA?G分子的生物学作用［10］。K562?HLA?G1细胞和外周血来源的DC共培养后，DC表面的免疫分子表型发生改变，表现为促进免疫活化的CD80、CD86分子表达下调，而诱导免疫抑制的ILT3、ILT4分子表达上升。这一结果和Liang等在［7］小鼠体内进行的实验结论相一致，提示HLA?G分子对DC发挥免疫抑制作用，使得DC表面的免疫分子表型向免疫负调节的方向，其中特征性的ILT3和ILT4高表达是免疫耐受性树突状细胞形成的标志。
混合淋巴细胞反应被用于研究高表达ILT3和ILT4的DC的免疫功能的影响。与转染HLA?G1分子的K562细胞共培养后的DC与未转染的对照组比较，作为同种异基因型抗原刺激PBMNC，促进PBMNC增殖的能力明显下降，这说明HLA?G1分子诱导后，高表达ILT3和ILT4的DC免疫功能发生负向改变；DC在免疫活化和呈递功能的执行中受到了抑制。这和Manavalan等［5］通过IL?10诱导产生耐受性的DC所获的结论相同，高表达ILT3和ILT4的耐受性DC在体外诱导T细胞耐受。
本研究在体外以膜表达型HLA?G1分子诱导DC高表达ILT3、ILT4，考察了ILT3+ILT4+DC在与同种异基因免疫细胞作用中的免疫负调节作用，初步探讨其在机体外周免疫诱导和维持过程中的作用机制。但是HLA?G1与ILT3和ILT4通过何种信号传导途径发挥作用，作用时其他共刺激分子的协同作用如何，这都有待进一步研究。这种研究将有助于发现骨髓移植后诱导外周免疫耐受和维持耐受更优化的方法，减低移植后患者免疫排斥反应的发生。
【文献】
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