砷剂和维甲酸对NB4细胞组织因子和凝血酶调节蛋白mRNA及促凝活性的影响

          作者：张晓辉　胡豫　洪梅　夏凌辉　郭涛　沈关心　魏文宁 宋善俊

【摘要】  　　为了研究三氧化二砷（As2O3）和全反式维甲酸(ATRA)对NB4细胞组织因子（TF）和凝血酶调节蛋白（TM）mRNA及其表达的影响，本研究采用体外细胞培养方法，以As2O3、ATRA处理NB4细胞，用ELISA动态测定其TF、TM抗原表达及促凝活性（PCA）变化，用逆转录?聚合酶链反应 （RT?PCR）测定TF和TM的mRNA转录。结果表明： 1 μmol/L的 As2O3 和1 μmol/L ATRA均可使NB4细胞TF抗原及mRNA表达呈时间依赖性渐进性下调；在24、48、72、96和120小时时间点，As2O3 组TF抗原的表达水平分别为13.3±1.8， 8.6±1.9， 10.8±1.5， 2.0±0.6和2.6±0.9 ng/107；ATRA组TF抗原的表达水平分别为12.4±1.1，11.3±1.8，5.7±1.7，2.8±0.8和2.0±0.6 ng/107，与对照组比较具有显著性（P＜0.05）；在不同的时间点As2O3 和 ATRA，均可使其PCA下降，As2O3 组血凝时间分别为 123.5±10.5，156.3 ±11.6， 179.3 ±15.3， 248.9±20.1， 312.0±29.8（秒）；ATRA 组血凝时间分别为 76.4±5.6，146.8 ±10.9，198.2 ±15.6， 265.8 ±20.6和363.8±31.9（秒）；ATRA使NB4细胞TM抗原表达及其mRNA转录上调。结论: As2O3 、ATRA可降低TF mRNA转录，下调TF蛋白表达，降低NB4细胞PCA；ATRA增高TM转录及表达，缓解APL患者凝血功能异常。

【关键词】  三氧化二砷；全反式维甲酸；NB细胞; 组织因子；凝血酶调节蛋白

　　Effects of Arsenic Trioxide or Retinoic Acid on mRNA and Protein Expression of Tissue Factor and   Thrombomodulin and Procoagulant activity in NB4 Cells

     Abstract    To investigate the effect of arsenic trioxide (As2O3 ) or all?trans retinoic acid (ATRA) on the mRNA and protein expression of tissue factor (TF) and thrombomodulin (TM) and procoagulant activity (PCA) in NB4 cells. The NB4 cells were cultured in vitro and treatecl with As2O3   or  ATRA, expression  of TF and TM antigen,   and PCA change of   treated NB4 cells  were detected with ELISA, TF and TM mRNA transcription on the NB4 cells was assayed  with  reversed transcription polymerase chain reaction (RT?PCR). The results showed  that  1  μmol/L As2O3  and  1 μmol/L ATRA both gradually downregulated  the expression of TF antigen and mRNA   on NB4 cells, a human promyelocytic leukemia   cell line, in time?dependent manner, as compared with  control. The levels of  TF antigen expression in AS2O3  group were 13.3±1.8， 8.6±1.9， 10.8±1.5， 2.0±0.6 and 2.6±0.9  ng/107 respectively;  while the  levels of TF antigen expression in ATRA group  were  12.4±1.1，11.3±1.8，5.7±1.7，2.8±0.8 and 2.0±0.6 ng/107 at 24, 48, 72, 96 and 120 hours  respectively(P＜0.05). The  procoagulant  activity (PCA)  of NB4 cells was decreased, blood coagulation times were  123.5±10.5，156.3 ±11.6，179.3 ±15.3，248.9±20.1，312.0±29.8 seconds  in As2O3 groups, respectively; 76.4±5.6，146.8 ±10.9，198.2 ±15.6， 265.8 ±20.6 and 363.8±31.9  seconds  in ATRA groups respectively  at 24,48, 72, 96 and 120 hours,（P＜0.05). ATRA  upregulated TM antigen  expression on NB4 cells.  It is concluded  that the As2O3  and ATRA decrease mRNA  transcription of  TF,  downregulate    expression of TF and  reduce procoagulant activity in NB4 cells. The TM transcription and expression upregulated by ATRA may alleviate dysfunction of coagulation in APL. 

    Key words    arsenic trioxide; all?trans retinoic acid; tissue factor; thrombomodulin; regulation；hemorrhage

    实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(2)砷剂和维甲酸对NB4细胞组织因子和凝血酶调节蛋白mRNA及促凝活性的影响        急性早幼粒细胞白血病（APL）是急性髓系白血病的独特亚型，由于t（15；17）形成pml/rarα嵌合基因，其编码PML/RARα融合蛋白是导致APL的重要机制；并易合并DIC等出血并发症。本研究以NB4细胞株为体外模型，研究NB4细胞组织因子（tissue factor, TF）和凝血酶调节蛋白（thrombomo?dulin, TM）mRNA表达，研究三氧化二砷（As2O3 ）对NB4细胞TF和TM mRNA转录及表达的影响，并与全反式维甲酸（ATRA）的作用进行比较；研究二者对APL细胞TF 和TM mRNA、抗原水平及促凝活性（procoagulant activity, PCA）的调控作用，阐明APL患者出血倾向及DIC等并发症的分子病理机制，为临床APL出血合并症提供实验依据。

    材料和方法

    细胞培养

    NB4细胞由上海第二医科大学瑞金提供，NB4细胞接种于24 孔板中，在含有10% FCS和100 mg/L链霉素、100  U/ml青霉素和L?谷氨酰胺的RPMI 1640 完全培养液中传代培养，细胞终浓度为1×106，用上述培养液隔日半量换液。细胞培养分3组：对照组：NB4细胞未做任何处理；As2O3 组：加入As2O3 终浓度为1 μmol/L；ATRA组：向培养细胞加入ATRA （Sigma 公司产品）1 μmol/L； 分别在0、24、48、72、96、120小时检测各组的细胞活力及抗原表达。

    NB4细胞促凝活性的检测

    根据［1］方法略作改进，用预冷GKN 洗涤NB4细胞并调整细胞浓度1×107/ml;取其100  μl并加入等体积混和人正常血浆（NHP），于37℃ 孵育2分钟, 加入100 μl 的25  mmol/L CaCI2溶液，用凝血仪检测其血液凝固时间。

    NB4细胞TF 抗原和TM抗原的检测

    与不同药物共孵育NB4细胞，在不同的时间点，用GKN洗涤3次后，计数并调整细胞浓度；每孔加入0.5% TritonX?100 200 μl作用30分钟,12 000× g离心20分钟，除去细胞碎片，分别用TF、 TM  ELISA试剂盒（ ADI公司产品）检测TF 和TM 抗原含量。

    NB4细胞活力及其分化抗原的检测［2］

    采用台盼蓝拒染法，检测培养细胞在不同时间点的活性。用GKN离心洗涤培养细胞3次，调整细胞终浓度1×106/ml，分别加1∶10 CD11b 和 CD33 McAbs( Sigma 产品) 50 μl, 4℃ 孵育30分钟, GKN洗涤后加羊抗鼠FITC 50 μl，4℃ 孵育30分钟，洗涤后用流式细胞仪（Becton  Dickinson公司产品）检测分化抗原，同时设阴性和阳性对照。

    TF mRNA 和TM mRNA转录的逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）检测

    采用一步法PCR试剂盒（Promega公司产品），反应体系为50  μl、AMV/Tfl 5×缓冲液10 μl、dNTP Mix 1μl，下游引物和上游引物各50 pmol、25 mmol/L MgSO4  2 μl，AMV  逆转录酶 1 μl、Tfl DNA 多聚酶 （5 U/μl）1 μl、RNA模板2    μl。同时设阳性对照。TM引物：上游引物为5′?CATGTGCGAGACGGG CTACCGGCTGGCGG?3′；下游引物：5′?AGGGGCT GGCACTGGTACTCGCAGTTGGC?3′；TF引物：上游引物5′?CTACTGTTTCAGTGTTCAAGCAGTGA?3′；下游引物为：5′?CAGTGCAATATAGCATTTGCAGTAGC?3′。扩增条件：48℃ 45分钟逆转录合成cDNA第一链；首轮反应94℃ 2分钟；94℃，30秒；50℃ 1 分钟；68℃ 2分钟，共35个循环，末轮反应为68℃，7分钟。扩增产物置于4℃冰箱保存。取10 μl  PCR产物，在1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色分析，在紫外光透射下进行凝胶摄影。

    统计学处理

    均数比较采用方差分析；方差不齐时，采用秩和检验。

    结    果

    As2O3 和ATRA对NB4细胞TF、 TM 抗原表达的影响

    以1 μmol/L  As2O3和1  μmol/L  ATRA分别处理NB4细胞，在0、24、48、72、96、120小时不同时间点检测显示，给药组NB4 细胞TF 抗原的表达较对照组显著下降，且随着孵育时间延长，呈渐进性降低；而 ATRA 对NB4细胞TM 抗原表达呈时间依赖方式显著增高（P﹤0.01）(表1, 2)。

    As2O3 和ATRA对NB4细胞PCA的影响

    As2O3 和ATRA可下调NB4细胞PCA的活性,随孵育时间的延长，血液凝固时间渐进性延长，由于血液凝固时间与PCA活性成反比，故其PCA活性渐进性下降（P﹤0.01）（表3）。

    As2O3 和ATRA对NB4细胞细胞活力的影响

    研究结果表明， 在120小时As2O3 组细胞活力的72.3±1.6%，  而ATRA组的细胞活力为81.9±4.0%，两组无统计学差异（P＜0.05）， As2O3和ATRA对NB4细胞的活力均无显著影响（图1）。

    As2O3 对NB4细胞TF和TM  mRNA转录的影响

    As2O3和ATRA 均显著下调NB4 细胞TF  mRNA转录； ATRA能显著上调NB4 细胞TM mRNA转录,而 As2O3 对NB4细胞TM mRNA转录无显著调节作用。图2中1、2、3、4、5、6 道分别代表在As2O3 、ATRA的作用下0、24、48、72、96、120小时TF mRNA的转录（P﹤0.01）。

　　讨    论

    TF 是一种含有糖基的单链跨膜蛋白，分子量47 kD，其基因位于染色体1p21-1p22,含有结构基因和调节序列两部分；TF作为凝血因子Ⅶ的辅因子和受体，是生理性凝血过程中最重要的启动因子［3，4］。正常机体中TF广泛而特异的表达构成一个保护层，与血液直接接触的细胞都不产生TF，确保生理条件下血液不会因TF表达而触发凝血；APL的出血机制是早幼粒细胞促凝物质的释放，APL细胞含有至少2种颗粒，TF和肿瘤促凝物质（PC）；PC存在于恶性组织和胚胎组织，是半胱氨酸蛋白酶，它可在凝血因子Ⅶ缺乏时直接激活因子Ⅹ［5］。

    本研究结果表明，给药组NB4细胞TF 抗原表达较正常对照组显著降低， 因TF 与PCA 密切关联，故其PCA相应降低，可能是APL患者临床易合并DIC的主要机制之一；另有研究表明，髓系白血病细胞的TF抗原、TF活性以及TF活性/TF抗原比率，较淋巴细胞性白血病细胞显著增高，白血病并发DIC患者较无DIC者亦显著增高［6，7］。NB4细胞在As2O3 和 ATRA处理前，具有潜在的高凝和纤溶亢进，在二者诱导NB4细胞向成熟分化同时，均可下调TF mRNA 转录和其蛋白表达，说明As2O3 和 ATRA临床APL期间，可早期减轻出血合并症的机制。

    TM 基因位于20号染色体P12（20p 12）,mRNA编码区序列1.7  kb, 它是一个多结构域的跨膜糖蛋白，分子量为60.3 kD, 其蛋白表达在内皮细胞表面［8］。血液凝血过程是一系列酶促连锁反应过程，限速因素是凝血辅因子，包括高分子激肽原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ。蛋白C系统是凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ的抑制物，包括凝血酶调节蛋白（TM）、蛋白C、蛋白S等, 凝血酶和TM的协同作用下蛋白C被激活，从而灭活凝血因子Ⅴa和凝血因子Ⅷa；在凝血酶和细胞表面的TM结合成复合物，此时凝血酶的功能发生改变，使凝血因子Ⅱ、血小板等功能丧失，成为蛋白C激活物, 从而改变凝血酶的促凝活性，使其发挥抗凝作用［2，9］。同时TM具有抗溶纤特性［10-12］。本实验结果表明，ATRA可显著上调TM mRNA及其蛋白表达，同时下调TF mRNA及蛋白表达；As2O3不影响TM的表达，与国外报道基本一致［3］。研究结果表明，As2O3 和 ATRA联合应用使NB4细胞TF抗原表达及PCA的降低具有协同作用［13，14］。

    Annexin Ⅱ是一种新近发现组织溶纤酶原激物（tissue plasminogen activator, t?PA)和溶纤酶原(plasminogen, PLG)的细胞膜表面共受体；其作用为激活t?PA介导的PLG，显著增加溶纤酶活性，而过度表达annexin Ⅱ可导致溶纤亢进，这是患者出血素质的形成主要原因之一；APL细胞表面高度表达annexin Ⅱ可引起溶纤酶生成失控，引起溶纤功能亢进而导致临床严重出血合病症。正常机体溶纤酶与α2?溶纤酶抑制剂结合而失活，Annexin Ⅱ过度表达可使α2?纤溶酶抑制剂耗竭，加剧潜在的出血合并症。Annexin Ⅱ的高水平表达是APL的标记物，它的高表达可使异常的溶纤亢进而加重出血；由于TM具有抗溶纤特性，ATRA促使TM的高表达可能有利于抗溶纤而纠正出血［15］。

    综上所述，As2O3  和ATRA 在体外均可显著下调TF抗原表达及其mRNA转录，ATRA可显著上调TM抗原表达及其mRNA转录，As2O3和ATRA均使PCA显著下降，从而减轻APL的出血合并症,并可防治急性播散性血管内凝血（DIC）的发生。

    致谢：衷心感谢导师宋善俊教授对本文的设计及大力支持；

    感谢北京大学人民血液病研究所黄晓军教授对本课题的指导和多方帮助。

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