胎盘因子的制备及其对淋巴细胞免疫调节作用的体外研究
【摘要】 为了建立制备胎盘因子（placenta factor, PF）的新方法，研究PF理化性质，并探讨PF体外应用对淋巴细胞的影响，应用超滤法制备PF，对PF的含量及各种成分的分子量进行测试，并以环孢素A(CsA)为阳性对照，生理盐水(NS)为阴性对照。应用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测植物血凝素（PHA）诱导的淋巴细胞增殖及混合淋巴细胞反应（MLR）；应用流式细胞术检测T细胞CD69的表达；应用乳酸脱氢酶释放法测定杀伤（NK）细胞对肿瘤细胞K562的杀伤作用。结果表明：在本研究中所制备的PF是一组小分子多肽类物质，主要含有两种成分，分子量分别为9.187 kD及4.794 kD；用Bradford法证实，多肽质量为5.7-6.9 mg/g鲜重胎盘。体外研究显示，PF抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖及混合淋巴细胞反应的作用与环孢菌素A（CsA）相当（P>0.05）。PF和CsA均可下调佛波酯（PMA）+离子霉素（ionomycin）刺激后T淋巴细胞活化抗原CD69的表达（PF vs CsA, P>0.05）。细胞杀伤试验显示， PF组NK细胞杀伤活性略高于或等于NS组（P>0.05），而CsA组杀伤活性明显低于NS组（P<0.05）。结论：建立了制备PF的新方法，并首次证实PF在体外对T细胞有强大的免疫抑制作用，可抑制由丝裂原及异基因抗原诱导的T细胞的增殖及活化，而且并不影响甚或促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。这一结果表明，PF在抑制移植物抗宿主病（GVHD）的同时，或许可以较好地保留移植物抗肿瘤效应（GVT），是一种较理想的、有应用潜能的抗GVHD制剂。
【关键词】 胎盘因子 淋巴细胞 环孢菌素A T细胞；NK细胞 免疫调节作用
Preparation of Placenta Factor and Its Immunoregulatory Effects on Lymphocytes In Vitro
Abstract The study was aimed to establish a new method of preparation of human placenta factor (PF) and to determine its physic?chemical properties, as well as effects on lymphocytes in vitro. PF was prepared by ultrafiltration. The contents and molecular weight of all constitutions were determined by Bradford method and SDS?PAGE, respectively. Cyclosporin A (CsA) was served as positive control, normal saline (NS) was used as negative control. PHA?stimulated lymphocyte proliferation and mixed lymphocyte reaction (MLR) were detected with MTT assay. The expression of CD69 on T cells was analyzed by flow cytometry. Cytotoxicity of natural killer (NK) cells against K562 tumor cells was examined with LDH release assay. The results indicated that PF was determined to be a group of low molecular weight polypeptides, consisting of two major components whose molecular weight were 9.187 and 4.794 kD respectively. The contents of PF were 5.7-6.9 mg/g fresh placenta. PF had similar suppressive effects on PHA?stimulated lymphocyte proliferation and MLR in vitro as compared with CsA （P>0.05）. Both PF and CsA could downregulate the expression of CD69 on T cells which had been stimulated by PMA plus ionomycin (PF vs CsA, P>0.05). The cytotoxicity of NK cells against K562 cells in PF group was slightly higher or equivalent as compared with that in NS group (P>0.05), but the cytotoxicity in CsA group was much lower than that in NS group (P<0.05). It is concluded that a new method of preparation of PF has been established. This study first demonstrates that PF has strong immunosuppressive effects on T cell in vitro, and suppresses T cell proliferation and activation induced by mitogen and alloantigen. This study indicats that PF has no any inhibitory effects, but even enhances the cytotoxicity of NK cells against K562 tumor cells. These results suggest that PF may have suppressive effects on graft?versus?host disease (GVHD) without diminishing graft?versus? tumor (GVT) effects. Therefore, PF may probably be an ideal and promising agent against GVHD.
Key words placenta factor; lymphocyte; cyclosporin A; T cell; natural killer cell; immunoregulutory effect
J Exp Hematol 2007; 15(3):567-572
胎盘组织功能复杂，是母体和胎儿之间的免疫屏障。许多学者证实，胎盘中的大分子蛋白胎盘球蛋白，以及胎盘组织培养上清、胎盘提取物等蛋白质成分的混合物，均可以抑制淋巴细胞的增殖与活化［1-4］。胎盘因子（placenta factor, PF）亦称胎盘肽，是从人胎盘组织中提取的小分子多肽类物质，具有免疫调节作用［5］，并且在临床上用于恶性肿瘤、病毒性肝炎、支气管哮喘及变应性鼻炎等病也取得了较好的疗效［6-10］，但PF的制备一直没有标准化，亦无商品生产化。本研究建立制备PF的新方法，探讨PF的理化性质及生物学活性，比较其与传统的免疫抑制剂环孢菌素A（cyclosporin A, CsA）对T细胞及NK细胞的影响。
材料
健康产妇胎盘，由北京大学人民产科提供。收集要求：于产后立即收集或不超过12小时，去除筋膜血管、生理盐水冲净、剪碎备用。另外，提供胎盘的产妇均为产前乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、弓形虫及梅毒检测均为阴性的健康产妇。
主要试剂及仪器
组织匀浆机A?88型为江苏金坛医疗仪器厂产品；低速台式离心机为德国Heraeus产品；超滤管（截留分子量10 kD）为美国Millipore公司产品；酶标仪为华东管厂产品；FACSsort型流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品；CO2培养箱为美国Forma公司产品；垂直板电泳槽为北京东方特力科贸中心产品；DYY?Ⅲ9A型电泳仪为北京六一仪器厂产品。
CsA为诺华公司产品；植物血凝素（PHA）、甲基噻唑基四唑（MTT)、佛波酯（PMA）、离子霉素均为Sigma公司产品；丝裂霉素C为罗氏公司产品；抗人CD3?FITC、抗人CD69?PE及同型对照?PE为美国Becton Dickinson公司产品；Cytoxicity Assay Kit为美国Promega公司产品。
PF的制备
应用超滤法制备PF（黄楚华的报道［11］，并做了重要改动）。步骤如下：胎盘剪碎、加2倍生理盐水（W/V），高速匀浆（2 380×g， 3分钟/次×10次），37℃水浴孵育1小时，113×g离心30分钟，上清液超滤（截留分子量10 kD），产物用Millipore滤器（220 μm）过滤除菌分装得到PF。
理化性质研究
蛋白质定性试验 采用加热醋酸法及20% 磺基水杨酸法进行蛋白质定性试验。
多肽质量的测定 采用 Bradford 法进行多肽质量的测定。公式为：
多肽质量(mg/g) =（多肽质量浓度×提取液总
体积／测定时取样体积）／胎盘组织质量
各种成分分子量的测定 应用SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS?PAGE）进行多肽分子量的测定［12，13］。分离胶、间隙胶及浓缩胶分别为：15.5% T 6% C（内含6 mol/L尿素），10% T 3% C及4% T 3% C。超低分子量标准品分子量范围：14.4 kD-3.313 kD。
生物学活性研究
淋巴细胞增殖试验 人外周血单个核细胞（PBMNC）接种96孔板，加入终浓度10 μg/ml的PHA和不同制剂。试验分3组：不同稀释度的PF（1/1, 1/2, 1/4, 1/6, 1/8及1/10）组、不同浓度的CsA（0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1及0.05 mg/ml）组及生理盐水（normal saline, NS）组，同时设立单纯培养液及未加PHA的对照孔。于37℃、 5% CO2孵箱中培育68小时，应用MTT法检测，并计算细胞生长抑制率。
生长抑制率（%）=1-（试验孔OD值／
无刺激孔OD值）×100
混合淋巴细胞反应 不同志愿者的PBMNC分别作为反应细胞和刺激细胞，刺激细胞以丝裂霉素C（终浓度60 μg/ml）处理，将反应细胞与刺激细胞按1∶1接种96孔板，加入不同制剂。分组情况同上，并设立单纯反应细胞、单纯刺激细胞及单纯培养基的对照孔，于37℃、 5% CO2孵箱中培育6天，应用MTT法检测，并计算细胞生长抑制率（同上）。
T细胞活化抗原CD69的表达 PBMNC接种24孔板，每孔加入PMA（终浓度200 ng/ml）、离子霉素（终浓度2μg/ml）及不同制剂。分组情况同上，并设立阴性对照孔，于37℃、 5% CO2孵箱中培育16-18个小时，按说明书标记抗体（阴性对照加入抗人CD3?FITC及同型对照?PE；余各标本加入抗人CD3?FITC及抗人CD69?PE），应用流式细胞仪检测CD3+ 细胞CD69的表达。
NK细胞杀伤试验 PBMNC接种于24孔板为效应细胞，加入不同制剂。试验分3组：不同稀释度的PF（1/1, 1/2, 1/4, 1/6, 1/8及1/10）组、不同浓度的CsA（0.2, 0.1及0.05 mg/ml）组及NS组。于37℃、 5% CO2孵箱培育12小时，取出效应细胞，重新计数接种96孔板。K562细胞株接种于96孔板作为靶细胞，效靶比20∶1，并设立效应细胞自发释放孔、靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、体积校正释放孔及培养基空白对照孔。余步骤按说明书进行，酶标仪检测OD490，并细胞杀伤率（%）。公式为：
细胞杀伤率=（A-B-C）/（D-C）×100
式中A=试验孔OD值－空白对照孔OD值，B=效应细胞自发释放孔OD值－空白对照孔OD值，C=靶细胞自发释放孔OD值－空白对照孔OD值，D=靶细胞最大释放孔OD值－体积校正孔OD值。
统计学方法
用SPSS 13.0统计软件包处理，实验结果用 ±SD表示，2个以上样本均数的比较采用方差分析（F检验），多个样本两两比较采用q检验（LSD法），P<0.05者具有统计学意义。
结 果
理化性质
PF外观呈微黄色透明液体，pH 6.8。加热醋酸法及20% 磺基水杨酸法蛋白质定性为阴性。
多肽质量 以标准蛋白质样品的OD590对标准蛋白质样品的质量浓度作图，得到回归方程，多肽质量浓度(y)=－0.459＋1.608 OD590(x)，R2=0.847，P=0.001，根据待测蛋白质样品的OD590，按回归方程求出PF的多肽质量为5.70-6.86 mg/g鲜重胎盘（6.28±0.58 mg/g）。
各种成分分子量 经SDS?PAGE发现PF为一组小分子多肽混合物，主要含有两种成分，以标准蛋白质样品的迁移距离对标准蛋白质分子量的对数作图，得回归方程，分子量对数（y）= 4.286－0.269迁移距离（x），R2=0.950，P=0.025，根据待测蛋白质样品的迁移距离，在方程中求出PF各主要成分的分子量分别为 9.187 kD及4.794 kD。
生物学活性
对PHA诱导的淋巴细胞增殖及混合淋巴细胞反应的影响 PF对PHA诱导的淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用，呈剂量依赖关系（图1），随PF稀释度增加，抑制作用逐渐减弱（各剂量组与NS组比较P=0.000），其中1/1、1/2及1/4 3个剂量组与CsA组比较分别为70.03% vs 67.91%（P=0.401）; 67.80% vs 67.23% （P=0.744）及59.33% vs 67.34% （P=0.104）。PF对混合淋巴细胞反应也具有显著的抑制作用，亦呈剂量依赖关系（图2）。随PF稀释度增加，抑制作用逐渐减弱（各剂量组与NS组比较P=0.000），其中1/1、1/2、1/4及1/6 4个剂量组与CsA组比较分别为78.90% vs 72.96 % （P=0.708）; 78.70% vs 73.43% （P=0.599）; 73.04% vs 73.54%（ P=1.000）及66.02% vs 74.25% （P=0.469）。上述结果表明，PF在体外抑制PHA诱导的T细胞增殖和混合淋巴细胞反应的作用与CsA相当。
讨 论
移植物抗宿主病（graft versus host disease, GVHD）是造血干细胞移植后常见的合并症，也是造成移植后死亡的主要原因。目前临床上所应用的免疫抑制剂，以及去除移植物中T细胞的各种方法均可以达到减轻GVHD的目的。但是，上述这些方法却提高了机会性感染、白血病复发和移植失败的发生率，并且还伴随有一定的毒副作用。因此，寻找控制GVHD的新方法一直是血液学界关注的重要问题。胎盘中含有多种具有生物学活性的物质，它们对维持胎儿与母体之间的免疫平衡起到重要的调节作用。以往，国外一些学者经过机械分离及酶消化作用得到胎盘绒毛膜细胞，并将细胞置于培养液中在37℃进行孵育，得到含有多种蛋白质成分的混合物即胎盘组织培养上清，并进一步证实这种上清液在体外可以抑制丝裂原诱导的淋巴细胞增殖及混合淋巴细胞反应，但并不抑制淋巴细胞通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞的功能［2-4］。这些发现提示我们，胎盘细胞可以分泌具有免疫调节作用的可溶性成份。此外，国内一些学者应用匀浆?透析及匀浆?超滤的方法从胎盘中提取了小分子的多肽类物质PF，生物学活性研究发现其具有良好的免疫调节作用，并经SDS?PAGE法证实PF是一组分子量小于5 kD的多肽类物质的混合物［5,11,14,15］。PF在临床上用于恶性肿瘤、病毒性肝炎、变态反应性疾病也获得了良好的疗效。基于上述结果，如果将PF用于骨髓移植患者，发挥其免疫调节作用，在降低GVHD的同时，保留机体对病原体及肿瘤的抵抗力，这和传统的免疫抑制剂相比具有很大优势。但是，到目前为止，PF的制备一直没有标准化，亦无商品生产化。因此，我们希望建立一种制备PF的简单方法，并对其理化性质及生物学活性进行研究。
在本试验中，国外提取胎盘组织培养上清的方法，对黄楚华［11］的超滤法做了重要改动。我们将新鲜胎盘组织匀浆液置于37℃进行孵育，孵育后经过低速离心获得胎盘组织上清液，上清液经过超滤制备出PF。在我们的制备方法中，增加了37℃孵育的步骤，并降低了离心转速，这与黄楚华的方法有明显不同。通过对本方法制备的PF的理化性质的研究，我们发现，该方法制备的PF外观呈微黄色透明液体，pH 6.8，蛋白质定性呈阴性，Bradford法测定多肽质量为5.7-6.9 mg/g鲜重胎盘，这与报道相似［5,11,14,15］。但SDS?PAGE显示，该方法制备的PF主要含有2种成分，分子量分别为9.187 kD及4.794 kD，这与既往文献报道不同［5,11,14,15］，这可能是因为37℃孵育及低速离心更有利于保留PF中分子量较高的活性成分。
已知GVHD的发生是由于供者T淋巴细胞受到受者抗原激活后大量增殖，并通过炎性细胞因子的分泌造成对受者正常组织的免疫损伤［16］。因此我们通过PF体外对T淋巴细胞功能的抑制作用来研究其对GVHD的抑制作用。当淋巴细胞受到丝裂原刺激时，即可发生增殖和分化，淋巴细胞增殖能力的强弱，在某种程度上代表了淋巴细胞功能的高低。混合淋巴细胞反应是用于检测供受者之间组织相容性的敏感方法，是预测器官移植中移植物的存活、GVHD的发生及其严重程度的指标。我们应用PHA诱导的淋巴细胞增殖及混合淋巴细胞反应来研究PF对T细胞的作用，并与CsA对比，发现PF抑制PHA诱导的淋巴细胞增殖及混合淋巴细胞反应的作用与CsA相当（P>0.05），并呈剂量依赖关系。CD69抗原亦称早期激活抗原，文献报道CD69可通过提高钙离子浓度，上调IL?2R的p55链，产生Th1型细胞因子，引发淋巴细胞增殖，起到信号传递功能［17］，CD69仅表达于活化的T细胞，而在静止的T细胞表面没有表达。我们应用流式细胞仪检测了PMA+离子霉素刺激后T细胞CD69的表达情况，发现PF可显著抑制由PMA+离子霉素诱导的T细胞活化，亦与剂量相关，尤其是在高剂量组，抑制作用强于CsA（P<0.05）。NK细胞具有广谱的抗肿瘤作用，尤其对淋巴瘤、白血病最为有效。另外，NK细胞还可以杀伤病毒感染的靶细胞，并且对某些胞内感染的细菌、真菌及寄生虫也有杀伤作用。我们应用乳酸脱氢酶释放法检测NK细胞对肿瘤细胞K562的杀伤活性，研究证实，PF不影响NK细胞对肿瘤的杀伤，甚至在某些剂量组，还可促进NK细胞对肿瘤的杀伤，但CsA却明显降低NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。上述体外试验结果表明，对T细胞而言，PF可以产生与CsA相当的免疫抑制作用；但与CsA不同，它不影响甚或促进NK细胞对肿瘤的杀伤。
本研究建立了一种制备PF的新方法，并首次证实PF体外应用对T细胞有强大的免疫抑制作用，可抑制由丝裂原及异基因抗原诱导的T细胞增殖及活化，同时不影响甚或促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。这些结果表明，PF在抑制GVHD的同时，或许可以较好地保留移植物抗肿瘤效应（GVT），是一种较理想的、有应用潜能的抗GVHD制剂。今后，我们将进一步研究PF在动物体内应用对机体免疫系统功能的影响。
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