人红细胞对糖类摄取的规律性研究
作者：权国波，吕翠翠，刘敏霞，扈文博，王艳，韩颖
【摘要】 人红细胞冰冻干燥保存在临床应用中具有重要意义。一些糖类，特别是海藻糖，能提高一些低等生物或细胞对干燥环境的耐受性，但如何将糖类导入细胞内又是一个挑战。本研究探讨人红细胞对糖类摄取的性。于不同温度（4、25和37℃）、不同浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L）及不同培育时间（1、3、5、7、9小时）条件下检测了红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率及游离血红蛋白量，并测定了红细胞变性指数。结果表明：随着温度的上升和细胞外糖浓度的增加，红细胞的糖吸收率也随之上升，细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度分别可以达到30 mmol/L和40 mmol/L以上。但孵育时间对海藻糖和葡萄糖的吸收率影响不同，随着时间的延长，细胞内海藻糖浓度呈先升高而后降低的趋势，而葡萄糖吸收率则呈稳定上升的趋势。但是糖吸收过程对红细胞的游离血红蛋白和变形性产生不利的影响，尤其是海藻糖，这主要来源于渗透压伤害。结论:红细胞的糖吸收率与孵育温度、外源糖浓度和孵育时间的关系密切，而且在一定条件下的糖吸收效率也较高，但此过程对红细胞有一定的伤害，这可能会影响糖类在红细胞冰冻干燥保存研究中的应用前景。今后的研究工作应集中于如何处理细胞伤害和糖吸收效率的关系。
【关键词】 人红细胞
Regularity of Sugar-Uptake in Human Red Blood Cells
Abstract Lyophilization of human red blood cells has important significance in clinical application. Some sugars，especially trehalose，can be more tolerant of some organism or cells to dry environments，But，how to bring sugars into cells is a challenge. This study was aimed to investigate the regularity of sugar-uptake in human red blood cells. The absorption rate of trehalose and glucose in red blood cells，free hemoglobin level and erythrocyte deformation index were determined at different incubation temperature (4，25 and 37℃)，different sugar concentration (0，0.2，0.4，0.6，0.8 and 1 mol/L) and different incubation time (1，3，5，7 and 9 hours). The results showed that with increase of temperature and extracellular sugar concentration，the uptake of sugar in red blood cells also increased，the intracellular trehalose and glucose concentrations were over 30 mmol/L and 40 mmol/L respectively. The effects of incubation time on uptake of trehalose and glucose were different. With prolonging of incubation time，the uptake of trehalose showed firstly increase and then decrease，however，the uptake of glucose showed a constant increase. But the loading process had side-effect on free hemoglobin and maximum deformation index (MAXDI) of red blood cells，especially for trehalose，which mainly come from high osmotic pressure. It is concluded that the uptake of sugars in red blood cells is closely dependent on incubation temperature，extracellular sugar concentration and incubation time. In certain condition，the efficiency of sugar uptake is very high，but this process also damages red blood cells so as to affect the application of sugars in lyophilization of red blood cells. The research in the future should focus on how to deal with the relation between cell injury and uptake efficiency of sugar in red blood cells.
Key words human red blood cells; trehalose; glucose; lyophilization
与传统的血液保存方法相比，红细胞冰冻干燥（冻干）保存具有很多优势：可以室温保存，重量轻，便于运输。这些优势使冻干保存更适合于战争和突发灾害等特殊环境［1，2］。尽管红细胞冰冻干燥保存具有重要的意义，但这项研究仍然面临着巨大的困难。通常人们认为在20世纪80年代以前的研究中没有获得一个结构完整的红细胞［3］。从20世纪90年代开始，许多研究者开始专注于此项研究，并获得一些让人振奋的结果［3-8］。然而，这些研究都面临着一个巨大的挑战：溶血问题。 一些研究表明，高浓度的上清游离血红蛋白主要是由于冻干和再水化过程中细胞膜的损伤引起的。 红细胞没有核，因此如何保护细胞膜是红细胞保存中的一个关键［1，2］。
近年来，糖类，包括海藻糖、蔗糖、麦芽糖以及葡萄糖等，在提高动物细胞或脂质体等细胞模型的耐干燥的效果引起了人们的关注。这些糖类，特别是海藻糖，可能为如何更好地保护细胞膜提出一个新思路。
研究表明，小分子糖类，如海藻糖、蔗糖和麦芽糖在稳定干燥细胞方面有特殊的效果［9］。Crowe等［10，11，12］详细讨论了海藻糖提高哺乳动物细胞对干燥或脱水耐受性的机制。Crowe［10］认为，海藻糖能代替大分子外的水膜，从而阻止干燥损伤。另外，海藻糖具有较高的玻璃态转变温度 (Tg)，能使干燥后的样品在室温下保持稳定的玻璃化状态。
Wolkers等［9］发现，血小板可以通过液相内吞作用吸收海藻糖，他采用这个方法冻干保存血小板取得成功，而且再水化后，血小板能在诱导剂的诱导下发生聚集反应。
然而，一些研究者认为对于红细胞的冻干保存而言，单糖，主要是葡萄糖的效果可能较好。Goodrich等［4］采用大分子物质羟乙基淀粉（HES）和葡萄糖作为主要保护剂冰冻干燥保存红细胞取得部分成功。我们的前期工作也证明，采用聚乙烯吡咯烷酮和葡萄糖作为主要保护剂冰冻干燥保存红细胞是可行的［1］。Crowe等［10］认为，尽管葡萄糖的Tg很低，但它能有效地降低冻干样品的熔融温度（Tm）；而大分子物质对Tm没有影响，但却具有较高的Tg，因此采用大分子物质和葡萄糖联合作为保护剂冻干保存红细胞是可能的。
本研究没有进行红细胞的冻干保存实验，而只是系统地研究了红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收规律，并对红细胞在此过程中受到的损伤进行了初步探讨，最终的目的是对葡萄糖和海藻糖在红细胞冻干保存中的应用效果进行评估，从而为今后更好地将糖类应用于红细胞的冻干保存打下基础。
材料和方法
试剂与溶液
如果没有特殊声明，所有的试剂均是分析级。海藻糖从Sigma公司购买。所有溶液均用超纯水配制。PBS (300 mOsm，pH 7.4) 包含 154 mmol/L NaCl，1.06 mmol/L KH2PO4，5.6 mmol/L Na2HPO4 和2 mmol/L 腺嘌呤。海藻糖或葡萄糖溶液为包含一定浓度海藻糖或葡萄糖的PBS缓冲液，pH 7.4。
红细胞的处理
全血取自解放军307 血库，加CPDA 抗凝。全血在4℃下600×g 离心10分钟去除白细胞和血小板。然后红细胞于相同条件下用PBS(300 mOsm，pH 7.4)离心洗涤3次。每次离心去除上层细胞，最后的浓集红细胞于4℃保存备用。
红细胞对海藻糖的吸收
红细胞对海藻糖的吸收率用改进的蒽酮比色法［14］测量。在整个试验中红细胞压积为22％。在温度试验中，红细胞于不同温度(4、 25 及 37℃)下在0.8 mol/L海藻糖溶液中孵育3小时。在浓度试验中，红细胞在不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8 及 1 mol/L)的海藻糖溶液中孵育3小时，温度为37℃。在时间试验中，37℃下红细胞在0.8 mol/L海藻糖溶液中孵育0，1，3，5，7小时。孵育后离心去上清，再在细胞中加入PBS（1 460 mOsm，pH 7.4），在相同条件下洗3遍。 在最后的细胞中加入80％甲醇混匀，在85℃下处理60分钟以完全破坏红细胞。然后取1 ml上清和2 ml蒽酮试剂混合均匀，在100℃下反应3分钟，然后在-20℃下降温。最后于分光光度计测量光吸收值，根据标准曲线求细胞内海藻糖浓度，波长为620 nm。
红细胞对葡萄糖的吸收
除了细胞内葡萄糖检测方法不同外，其它的操作步骤与红细胞对海藻糖的吸收步骤相同。红细胞对葡萄糖的吸收率用葡萄糖氧化酶法测定，检测试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。
游离血红蛋白
红细胞和海藻糖或葡萄糖溶液在一定条件下孵育后，离心取上清，用苯息丁法［1］测定游离血红蛋白浓度。
红细胞变形性
红细胞与海藻糖或葡萄糖缓冲液共孵育后，40 μl细胞悬液和0.8 ml 15% 聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) (分子量约为40 kD)混合均匀，在LG-B-190 EKTACYTO METER ( GTM - Steellex Instrument Co Ltd)变形仪上测量最大变形指数（maximum deformation index，MAXDI）。
统计学分析
细胞内海藻糖或葡萄糖浓度、游离血红蛋白和变形性（MAXDI）用One-Way ANOVA 和LSD multiple comparison (SPSS软件)分析。 P<0.05或P<0.01 被认为差异显著。在本实验中数据表示为平均值 ± 标准差(X±D)。
结 果
孵育温度对红细胞糖吸收的影响
由图1A可以看出，随着孵育温度的升高，红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率均呈上升的趋势，但红细胞对葡萄糖的吸收率要高于海藻糖。我们认为，这主要是由于葡萄糖分子较小，更易于进入红细胞。当温度为4℃时，无论是海藻糖还是葡萄糖，细胞内糖浓度只有5 mmol/L左右，显著低于25℃和37℃时的糖吸收率。当温度为37℃时，细胞内海藻糖浓度为25 mmol/L左右，而葡萄糖的吸收率则更高，达到将近40 mmol/L。但是从图1B、C可以发现，随着温度的升高，红细胞的MAXDI下降，而游离血红蛋白则呈上升的趋势，这说明糖吸收过程对细胞造成一定伤害。同时海藻糖孵育对红细胞变形性的损伤要高于葡萄糖。随着温度的上升，吸收葡萄糖的红细胞的游离血红蛋白浓度不到0.05 g/L，显著低于海藻糖处理组（P<0.01）。
细胞外糖浓度对红细胞糖吸收的影响
由图2A看出，随着糖溶液浓度的上升，细胞内的糖浓度也随之增加，但葡萄糖吸收的增加幅度明显高于海藻糖，当葡萄糖浓度为1 mol/L时，葡萄糖的吸收率在30 mmol/L以上，而海藻糖的吸收率仅为20 mmol/L左右。另外，从图2B可以看出随着糖溶液浓度的升高，红细胞的MAXDI呈逐渐下降的趋势，其中海藻糖对细胞变形性的影响要大于葡萄糖，当糖浓度为0.8 mol/L时，吸收海藻糖的红细胞的MAXDI仅为0.25左右，吸收葡萄糖的红细胞的MAXDI却在0.40左右。从图1C可以看出，海藻糖和葡萄糖溶液对红细胞游离血红蛋白的影响差别很大，随着浓度的上升，海藻糖处理组红细胞游离血红蛋白呈显著上升的趋势，当海藻糖浓度为1 mol/L时，其游离血红蛋白在0.40 g/L左右，显著高于葡萄糖处理组（P<0.01）；而葡萄糖浓度对红细胞上清游离血红蛋白的影响不大，均低于0.05 g/L。
孵育时间对红细胞糖吸收率的影响
由图3A可以看出，红细胞对海藻糖的吸收率随孵育时间的变化不同于葡萄糖。随着孵育时间的延长，红细胞对葡萄糖的吸收率呈逐步上升的趋势，当时间为9小时时，细胞内葡萄糖浓度在45 mmol/L左右；而细胞内海藻糖浓度随时间延长呈先升高而后降低的趋势，当时间为3小时时，吸收浓度最高，仅为20 mmol/L左右，显著低于葡萄糖吸收率(P<0.01)，此后呈缓慢降低的趋势。从图3B可以看出，随着孵育时间的延长，红细胞的游离血红蛋白呈上升的趋势，但海藻糖处理组对游离血红蛋白的影响大于葡萄糖。当时间为9小时时，海藻糖处理组红细胞的游离血红蛋白浓度高于0.75 g/L，显著高于葡萄糖组(P<0.01)；而孵育时间对葡萄糖组红细胞游离血红蛋白的影响不大，整个处理期间，其游离血红蛋白浓度均低于0.1 g/L。从图3C看出，随着孵育时间的延长，红细胞的MAXDI呈下降的趋势，但海藻糖对MAXDI的影响要大于葡萄糖。
讨 论
如何将糖类导入红细胞并达到一个相对较高的细胞内浓度将影响着糖类在红细胞的冰冻干燥保存研究中的应用前景。本实验检验了红细胞对寡糖（海藻糖）和单糖（葡萄糖）的吸收情况，同时对红细胞在糖吸收过程受到的伤害进行了评价，最终的目标是优化红细胞糖吸收过程，为进一步开展红细胞的冰冻干燥保存研究打下基础。
我们发现，红细胞主要通过简单扩散的方式吸收葡萄糖，即葡萄糖是沿着浓度梯度进入细胞；而海藻糖的吸收可能更复杂，因为在正常生理条件下，海藻糖由于分子较大而无法通过细胞膜。Satpathy［13］认为，海藻糖通过渗透压差异和膜相变的联合作用进入红细胞内。而渗透压差异是简单扩散的一个必要条件，所以简单扩散在海藻糖吸收中也可能扮演重要角色。协助扩散需要膜转运蛋白的协同作用，从本实验来看，协助扩散不可能起主要作用，因为协助扩散在较低的浓度下即可以达到较高的转运效率。从整个实验来看，葡萄糖的吸收效率高于海藻糖，这主要是由于葡萄糖分子小，更易于进入细胞内，而海藻糖分子较大，在相同的处理条件下，海藻糖进入细胞的速率较慢，所以红细胞对其吸收率也相应降低。
红细胞糖吸收率和温度、细胞外糖浓度以及孵育时间密切相关。图1A表明，随着温度的上升，红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收呈显著上升的趋势，这说明较高的温度可以提高糖吸收率。Wolkers等［14］发现，红细胞质膜在14℃时有一个低协同性相变，这个相变主要是由于磷脂的熔解而引起的，而另一个相变点在34℃左右，这主要是由于胆固醇和鞘脂类富集区的熔解而引起的。在本实验中，当孵育温度为37℃时，葡萄糖和海藻糖的吸收率最高，这表明膜磷脂相变，尤其是胆固醇和鞘磷脂的变化对糖吸收有重要影响。
另外，从图2A可以看出，随着糖浓度的升高，红细胞对糖的吸收效率也随之上升。而糖浓度的升高对应着渗透压的升高，所以较高的渗透压差能促进红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率。另外在相同的浓度条件下，葡萄糖溶液的渗透压低于海藻糖溶液，所以红细胞对葡萄糖的吸收效率要高于海藻糖。
但是孵育时间对红细胞葡萄糖和寡糖吸收率的影响是不同的。随着时间的延长，红细胞对葡萄糖的吸收率也随之上升，但海藻糖的吸收率呈先升高而后降低的趋势（图3A），这和Satpathy等［13］的结果不同。Satpathy认为，细胞内海藻糖浓度随着孵育时间的延长而增加。我们认为红细胞在洗涤过程中受到了渗透压的伤害而造成细胞数的减少(数据没有提供)，因此随着时间的延长，海藻糖吸收率反而下降。
糖吸收过程对红细胞造成一定的伤害。随着温度的升高、细胞外海藻糖浓度和孵育时间的增加，红细胞的变形性和上清游离血红蛋白指标均逐渐变差。我们认为，这些损伤主要来源于渗透压的变化。在本实验中，我们发现海藻糖对细胞的伤害要高于葡萄糖，这主要是由于在相同浓度条件下，海藻糖溶液的渗透压要高于葡萄糖溶液，所以对细胞造成的伤害相应也较大。另外，尽管细胞膜相变能促进红细胞对糖的吸收，但也可能对细胞造成一定损伤。
总之，本实验表明红细胞可以通过简单扩散吸收海藻糖和葡萄糖，而且渗透压和膜相变对红细胞对葡萄糖和海藻糖的吸收也有一定的促进作用，其中红细胞对于葡萄糖的吸收效率要高于海藻糖。红细胞糖吸收效率的提高与细胞受到的伤害存在一定的协同关系，即在糖吸收率提高的情况下，红细胞受的伤害也相应增加。尤其是海藻糖对细胞的损伤更大。所以，今后如果要将糖类应用于红细胞的冰冻干燥保存中，必须要协调好提高糖吸收率和减少细胞损伤的关系。
【】
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