去铁胺激活半胱天冬酶3诱导HL-60凋亡
【摘要】 为了研究铁螯合剂—去铁胺（deferoxamine，DFO）诱导人白血病细胞株HL-60凋亡时半胱天冬酶-3（caspase-3）活性的变化并探讨DFO诱导凋亡的可能机制。 HL-60细胞经HE染色，在光学显微镜下观察其形态结构变化，用TUNEL法和流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡，免疫组织化学法检测caspase-3活性，原位杂交法检测凋亡基因bax的转录水平。 结果表明，HL-60经去铁胺处理后，典型的细胞形态改变、DNA末端原位标记和FCM检测均证实DFO可诱导细胞凋亡，凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性。 在DFO 诱导HL-60凋亡过程中，caspase-3活性明显升高，凋亡基因bax的转录水平均较对照组增高（P<0.05）。caspase广谱抑制剂Z-AVD可明显降低DFO诱导的细胞凋亡率。 结论： DFO通过激活caspase-3和增强bax活性而诱导HL-60凋亡。
【关键词】 细胞凋亡
Deferoxamine Induces Apoptosis of HL-60 Cells by Activating Caspase-3
Abstract This study was purposed to observe the changes of caspase-3 activity during apoptosis of HL-60 cells induced by an iron chelator，DFO (deferoxamine)，and to explore the mechanism underlying apoptosis in HL-60 cells. The HL-60 cells treated with DFO were examined by light microscopy，flow cytometry (FCM) and DNA agarose gel electrophoresis; the activity of caspase-3 was determined by cellular immunohistochemistry; the transcription of the apoptotic gene of bax was detected by hybridization in situ. The results showed that the typical morphological character of apoptosis cells，DNA ladder and FCM assay confirmed that DFO could induce the apoptosis in HL-60 cells. The apoptotic rate increased in dose-and time-dependent manner. When cells had been cultivated with 100 μmol DFO for 12 hours，a few caspase-3 positive cells were found. In the process of time，the rate of caspase-3 positive cells was progressively higher than that in control(P<0.05)，while the level of bax transcription was also higher than that in the control. It is concluded the activation of caspase-3 and gene bax may be involved in the apoptosis of HL-60 cells induced by DFO.
Key words deferoxamine；HL-60 cell；apoptosis； caspase-3
去铁胺（deferoxamine，DFO）是以铁螯合物的形式从多毛链霉菌中分离、经化学方法处理后得到的不含金属的配体，它对铁的亲和力极高（Ka＝1031），常用于铁中毒和一些输血性铁质沉着病。近年来研究发现，铁螯合剂可抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导凋亡，有望成为一种新的抗肿瘤因子［1，2］。但有关DFO诱导白血病细胞凋亡的机理研究的报道，国内外较少见。Caspase是哺乳动物细胞中普遍存在的半胱氨酸－门冬氨酸特异蛋白酶，其在凋亡过程中起着关键性作用［3］。本研究拟观察半胱天冬酶-3(caspase-3)的活性在DFO诱导HL-60细胞凋亡过程中的变化，以探讨DFO诱导白血病细胞凋亡的可能机制。
材料和方法
材料
HL-60细胞由北京协和基础医学研究所细胞中心提供；去铁胺（DFO）为瑞士Giba公司产品；RPMI 1640培养液为美国Gibco公司产品；精制小牛血清为美国Hyclon公司产品；噻唑兰（MTT）为美国Sigma公司产品；原位细胞凋亡检测试剂盒为德国Boehringer Mannheim公司产品；膜联蛋白Ⅴ（Annexin V）检测试剂盒为深圳晶美公司产品； Bax 原位杂交试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品；
流式细胞仪（FACScan，）购自美国Becten Dickinson公司。
细胞培养及分组
HL-60细胞接种于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中常规传代培养。收集对数生长期细胞进行实验，试验组分别加入10、50、100 μmol/L DFO共培养，对照组加生理盐水。
细胞形态观察
收集经药物作用后的细胞，涂片凉干，HE染色，油镜下观察。
流式细胞术检测
收集1×106 个细胞，PBS洗3次，重悬于500 μl 缓冲液，加入5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI，混匀，室温避光15分钟，PBS洗后，流式细胞仪检测。
DNA琼脂糖凝胶电泳
经0、50、100 μmol/L DFO作用48小时后，每样品收集1×106个细胞，酚－氯仿常规抽提DNA，取样加入1.5％琼脂糖凝胶电泳1-2小时，0.5 μg/ml溴乙啶溶液染色后，紫外灯下观察结果并拍照。
细胞免疫组织化学法检测胞内半胱天冬酶 3活性
收集细胞涂片、固定，滴加1∶150稀释的一抗，洗涤3次，滴加二抗和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，DAB-底物显色，以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性。随机记数300个细胞，阳性率，阳性率＝阳性细胞数/300×100%。
原位杂交法检测bax RNA
收集细胞涂片、固定，3％ H2O2/甲醇孵育30分钟，滴加预杂交液恒温40℃孵育3小时，滴加含寡核苷酸探针原位杂交液恒温38℃孵育过夜，滴加生物素化鼠抗地高辛，DAB显色。细胞阳性率计算方法同上。
统计学处理
实验数据均以均数±标准差（X±D ）表示，采用t检验。
结果
细胞形态学改变
收集细胞涂片、凉干，HE染色后光镜下可见细胞胞膜皱缩，染色质凝集、边缘化，胞质起泡，甚至有凋亡小体形成。而对照组细胞大小均匀，形态正常。
DFO浓度和作用时间与细胞凋亡的关系
10、50和100 μmol/L DFO分别作用于HL-60细胞24、48和72小时，随着作用时间的延长，凋亡率也随之增加，表明DFO呈剂量和时间依赖性地诱导细胞凋亡（表1）。各组与对照组相比均有显著性差异（P<0.05）。Table. Effects of the acting time and concentration of DFO on the apoptotic rate of HL-60 cell（略）
DNA降解
HL-60细胞经50 μmol/L DFO作用48小时，100 μmol/L DFO作用24小时后，对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果均出现特征性梯形条带，而对照组缺如（附图）。
半胱天冬酶 -3的激活
HL-60细胞经100 μmol DFO作用12小时，半胱天冬酶-3活性亚单位P17免疫活性即开始上升，阳性细胞率为(8.63±0.47)％，对照组阳性细胞率为(1.04±0.7)％，随作用时间的延长阳性细胞率逐渐升高，至72小时达峰值，而后下降。同一时间点上与对照组相比均有显著性差异（P<0.01）。
半胱天冬酶抑制剂对凋亡的阻抑作用
将半胱天冬酶广谱抑制剂Z-AVD与细胞预孵育，使终浓度为10 μg/ml，半小时后加入100 μmol的DFO，作用24小时和48小时，经Annexin V-FITC染色，上流式细胞仪检测。结果表明，凋亡率分别由原来的22.60％、30.52％下降到13.29％、19.65％，(t1=13.138， P<0.01；t2=5.224，P<0.05)。
促凋亡基因bax转录的变化
经100 μmol DFO作用24小时和48小时后，用原位杂交法检测细胞内bax RNA，阳性细胞率分别为6.11％和11.78％，与对照组的2.49％和3.89％相比具有显著性差异（t1=9.704，P<0.01；t2=9.871，P<0.01）。
讨 论
大量的体外实验和临床研究表明，去铁胺（DFO）可通过螯合细胞内的铁而抑制肿瘤细胞的生长，具有明确的抗肿瘤细胞增殖效应。研究发现DFO能直接诱导HL-60细胞株凋亡［4］，但其诱导细胞凋亡的机制尚不明了。
本研究结果显示，经DFO处理的HL-60细胞呈现典型的凋亡形态学特征，并出现DNA 梯状条带，进一步用流式细胞术可检测到Annexin V-FITC阳性标记的凋亡细胞，提示去铁胺可诱导细胞凋亡，且凋亡率与药物的剂量和作用时间呈依赖性。因此诱导凋亡是DFO抗肿瘤的重要机制。在此基础上，我们对DFO诱导HL-60细胞凋亡的可能机制作了进一步的探讨。
Caspase是哺乳动物细胞中普遍存在的半胱氨酸－天冬氨酸特异蛋白酶，其在凋亡过程中起着关键性作用［3］。Caspase分为两大类：一类为启动酶，另一类为效应酶。Caspase-3是caspase效应酶之一，通常以酶原形式存在，通过蛋白水解其内部保守的天冬氨酸残基，形成一有活性的17 kD亚单位［5］，即半胱天冬酶-3亚单位—P17。活化的caspase-3直接或通过激活下游的caspase-6、-7等裂解细胞骨架蛋白，降解DNA，执行凋亡。本研究发现，100 μmol DFO 作用HL-60 细胞12小时后，通过抗P17抗体可检测到细胞内P17免疫活性的升高，caspase-3阳性细胞率为8.63％±0.47％，对照组阳性细胞率为1.04%±0.7％，二者相比有显著性差异（P<0.01）。随作用时间的延长，阳性细胞率逐渐升高，至72小时达峰值，而后下降，这表明caspase-3在这一凋亡过程中被激活。实验还发现，半胱天冬酶抑制剂Z-AVD可使DFO处理过的细胞凋亡率明显下降，说明caspase-3活性受抑制可降低细胞凋亡率，进一步证实了caspase-3在DFO诱导细胞凋亡过程中的重要作用。
我们从RNA的分子水平又发现，DFO作用HL-60细胞后，凋亡基因bax转录水平明显增高，与对照组相比具有显著性差异（t=5.75，P<0.05），这提示DFO可促进凋亡基因bax的转录，这与Jiang等［6］的研究结果相符。
本研究结果提示，caspase的活化及bax活性的增强可能是DFO诱导HL-60细胞凋亡的重要机制。但有关DFO诱导HL-60细胞凋亡的分子机理尚有待于进一步研究。
【】
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