亚硒酸钠对K562/ADR多药耐药的逆转作用及其机制
作 者：崔晶,丁璟,吴轶苹,刘复强,刘小超,王阳
【摘要】 本研究探讨亚硒酸钠对白血病耐药细胞株K562/ADR细胞的多药耐药性的逆转作用及其逆转机制。 用噻唑蓝（MTT）法检测亚硒酸钠对K562/ADR细胞的生长抑制作用及其对K562/ADR细胞耐药性的逆转作用；应用流式细胞仪检测亚硒酸钠对K562及K562/ADR细胞凋亡率的影响；用半定量RT?PCR法检测K562/ADR细胞中mdr1和bcl?2基因的表达情况。 结果表明，10 μmol/L亚硒酸钠可以明显增加K562/ADR细胞对阿霉素敏感性，其耐药逆转倍数为2.31；早期凋亡率在10 μmol/L亚硒酸钠作用于K562细胞48小时是升高的；而中、晚期凋亡率在亚硒酸钠5、10 μmol/L作用48、72小时时均明显升高；两种浓度亚硒酸钠在作用48小时可使K562/ADR细胞早期凋亡率增加，作用48、72小时可使K562/ADR的细胞中、晚期凋亡率增高，10 μmol/L的亚硒酸钠所致凋亡率高于5 μmol/L，作用72小时的凋亡率高于48小时；亚硒酸钠可使K562/ADR细胞mdr1 mRNA及bcl?2 mRNA表达下降。 结论： 亚硒酸钠可部分逆转K562/ADR细胞的耐药性，其机制可能是增加K562/ADR细胞凋亡率，下调mdr1 mRNA和bcl?2 mRNA的表达。
【关键词】 细胞凋亡
Reversal Effect of Sodium Selenite on Multidrug Resistance in K562/ADR Cell Line and Its Mechanisms
Abstract This study was purposed to investigate the reversal effect of sodium selenite on multidrug resistance in adriamycin?resistant leukemic cell line K562/ADR and its mechanisms. The cytotoxicity and the reversal effect of sodium selenite on K562/ADR cells were assayed by MTT method; the apoptosis rate of K562 and K562/ADR cells were detected by flow cytometery, the mRNA expressions of mdr1 and bcl?2 were measured by semi?quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT?PCR). The results showed that 10 μmol/L sodium selenite significantly increased the cytotoxicity of adriamycin to K562/ADR cell and the reverse index（RI）was 2.31; the early apoptosis rate of K562 cells was elevated after treatment with 5 μmol/L Na2SeO3 for 48 hours；and the medium?term and late apoptosis rate was elevated after treatment with both 5 and 10 μmol/L Na2SeO3 for 48 and 72 hours. Both doses of 5 and 10 μmol/L Na2SeO3 increased the early apoptosis rate of K562/ADR at 48 hours，and also increased the medium?term and late apoptosis rate after treating for 48 and 72 hours. The apoptosis rate was higher at dose of 10 μmol/L than that at 5 μmol/L， the apoptosis rate at 72 hours also was higher than that at 48 hours. The expressions of mdr1 mRNA and bcl?2 mRNA were decreased significantly by 10 μmol/L sodium selenite. It is concluded that sodium selenite can reverse the multidrug resistance in K562/ADR partially by down?regulating the expressions of mdr1 mRNA and bcl?2 mRNA, and increasing apoptosis rate of K562/ADR cells.
Key words Na2SeO3; K562/ADR cell; multidrug resistance; apoptosis
J Exp Hematol 2007; 15(4):756-761
白血病诱导化疗失败和缓解后复发的重要原因之一是白血病细胞耐药性的形成。 多药耐药(multidrug resistance, MDR) 是化疗耐药的主要形式。对多药耐药性产生的机制及其逆转的研究一直是肿瘤研究领域的一个热点。目前备受关注的耐药逆转剂主要有钙离子拮抗剂、环孢菌素A等，但这些药物在体内应用时，因毒副作用过大很难达到体外实验所要求的最佳逆转浓度，因而未能广泛应用于临床。
硒作为人体必需的微量元素，能提高机体免疫力。已有研究报道，硒可增强某些抗肿瘤药的化疗效果，但关于硒是否可逆转白血病细胞耐药性的研究尚十分少见。本研究探讨了亚硒酸钠对K562/ADR多药耐药性的逆转作用及逆转机制，以期为临床上应用硒制剂克服肿瘤细胞的多药耐药性，提高化疗疗效提供部分实验依据。
主要试剂和材料
亚硒酸钠、噻唑蓝（MTT）及二甲亚砜（DMSO）为sigma公司产品。RPMI 1640培养液及胎牛血清（FBS）购自医学院细胞中心。TRIzoL及RT?PCR试剂盒购自北京博大泰克生物有限公司。mdr1、bcl?2和β?actin引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。CO2细胞孵育箱为Heraeus公司产品；Model 450酶标仪为BIO?RAD公司产品； PCR仪为Beckman公司产品；图像分析仪为Serial公司产品）;流式细胞仪为美国Becton Dikinson公司产品。
白血病细胞株及实验分组
敏感细胞株 K562和耐药细胞株 K562/ADR均购自中国医学科学院天津血液病研究所。分别将两种细胞株设立为A、B、C 3组，其中A组（对照组）不加药，B组加亚硒酸钠5 μmol/L，C组加亚硒酸钠10 μmol/L。K562细胞为A1、B1、C1，K562/ADR细胞为A2、B2、C2。所有细胞均置含10%胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml的RPMI 1640培养液中培养，培养条件为：37℃、5% CO2、饱和湿度。K562/ADR细胞的培养液中需加入1 μg/ml阿霉素，实验前2周脱药培养。
逆转耐药的MTT检测
取对数生长期细胞，以1×105/ml的细胞悬液浓度接种于96孔板，每孔细胞的悬液为100 μl，加入不同浓度亚硒酸钠及RPMI 1640培养液至每孔总体积达200 μl，每一药物浓度设平行3孔，培养72小时后行MTT实验。酶标仪570 nm处测吸光度值，细胞增殖抑制率和IC50。
细胞存活率 =（加药组OD值/对照组OD值）×100%
细胞增殖抑制率= ［1-（加药OD值/对照OD值）］×100%
IC50：细胞增殖抑制率为50%时的药物浓度
耐药逆转倍数＝对照组IC50/试验组IC50
细胞凋亡率的流式细胞术测定
取对数生长期的A、B、C 3组细胞，以2×105/ml的密度分装到不同的培养瓶中，分别于48、72小时后加入长春新碱（VCR）5 μg/ml，继续培养24小时。收集细胞，分别用PBS洗细胞2次，悬浮于1×缓冲液中，再各取100 μl上述溶液加入新的培养管，分别加入5 μl Annexin V?FITC和5 μl PI,轻轻混合后置于暗处孵育15分钟，加入400 μl 1×缓冲液到每个管中，于1小时内行流式细胞仪检测。
mdr1和bcl?2 mRNA表达水平的测定
取对数生长期细胞，调细胞浓度为1×105/ml。采用TRIzoL试剂提取总RNA，按试剂盒说明进行逆转录反应。 mdr1上游引物：5′?CCCATCATTGCA ATAGCAGG?3′，下游引物：5′?GTTCAAACTTCTGC TCCTGA?3′，扩增片段157 bp；bcl?2上游引物：5′?G AGACATCAGCATGGCTCAA?3′，下游引物：5′?G TCCAAGGTCATGGTTGTCC?3′，扩增片段301 bp；β?actin上游引物：5′?GGACTTCGAGCAAGAGAT GG?3′，下游引物：5′?AGCACTGTGTTGGCGTAC AG?3′,扩增片段为234 bp。共扩增35个循环，具体扩增条件及操作步骤按试剂盒说明进行。取10 μl扩增产物，置2%琼脂糖凝胶（含EB 0.4 mg/L）上电泳。用图像分析仪分析条带，应用mdr1和bcl?2与β?actin基因条带的密度比值计算表达强度。
统计学方法
采用t检验，用SPSS 11.0统计软件进行分析。
结 果
药物浓度的选择
当亚硒酸钠浓度在 10 μmol/L以下时，与未加药对照组相比，其对细胞生长无明显的抑制作用（增殖抑制率<5%），故选择亚硒酸钠5 μmol/L和10 μmol/L作为实验浓度。
亚硒酸钠对K562/ADR细胞的阿霉素耐药性的影响
阿霉素对K562和K562/ADR细胞作用72小时时的 IC50 值分别为： （0.049±0.002） μg/ml和（8.28±1.27） μg/ml，即K562/ADR细胞的耐药性是K562的169倍。亚硒酸钠对于K562细胞对阿霉素的敏感性无影响作用，对于K562/ADR细胞对阿霉素敏感性的影响见表1。
B组48和 72小时的IC50值分别为：（10.01±1.11）μg/ml 和（7.89±1.02）μg/ml；C组48和 72小时的IC50值分别为：（10.01±1.13）μg/ml 和（3.58±0.26）μg/ml。此实验结果表明5 μmol/L亚硒酸钠作用48和 72小时均不使K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性明显增加，耐药逆转倍数为1.03-1.05；10 μmol/L亚硒酸钠在48小时对K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性也无影响，在72小时可以增强K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性，耐药逆转倍数为2.31倍。这提示亚硒酸钠对K562/ADR的逆转耐药作用呈浓度和时间依赖性。
对K562和K562/ADR细胞株不同时间诱导凋亡及凋亡率的变化
硒对K562细胞凋亡的诱导 B1组和C1组的K562细胞在48、72小时总凋亡率较未加药的A1组明显升高（p<0.01），并且C1组总凋亡率高于B1组；72小时的总凋亡率高于48小时（表2）。5、10 μmol/L亚硒酸钠作用48小时对K562细胞早期凋亡率没有明显影响，作用72小时早期凋亡率下降；而两种浓度亚硒酸钠在不同时间导致的中晚期凋亡率均明显升高（p<0.01）（表3、表4，图1、图2）。
硒对K562/ADR细胞凋亡的诱导
实验结果见表5。由表5可见，B2组和C2组的K562/ADR细胞在48、72小时总凋亡率较之未加药组A2组明显升高，并且在48小时C2组总凋亡率高于B2组。两种浓度亚硒酸钠在作用48小时可使K562/ADR细胞早期凋亡率增加，5 μmol/L亚硒酸钠作用72小时早期凋亡率下降，10 μmol/L亚硒酸钠作用72小时早期凋亡率没有明显变化。两种浓度的亚硒酸钠在48、72小时均可使耐药K562细胞株中晚期凋亡率明显增高（表6、表7，图4、5）。
亚硒酸钠对mdr1基因表达的影响
K562细胞无mdr1基因表达，mdr1与β? actin基因条带的密度比值为0； K562/ADR细胞mdr1基因为阳性表达，mdr1与β? actin基因条带的密度比值为0.474±0.002，A组和B 组分别下降至0.332±0.002和0.327±0.008，与未处理组相比差别有统计学意义（p<0.05）(图5)。
亚硒酸钠对bcl?2基因表达的影响
实验证明K562和K562/ADR细胞bcl?2基因均为阳性表达，K562/ADR细胞表达水平略高。bcl?2与β?actin基因条带的密度比值，在K562/ADR细胞为1.245±0.142，经5和10 μmol/L亚硒酸钠预处理72小时后，比值分别下降至0.508±0.089和0.462±0.121，与未处理组相比差别有统计学意义（p<0.05），但未达到K562水平（0.441±0.075）(图6)。
讨 论
实验证实，K562/ADR细胞株是mdr1 基因高表达的细胞株［1］，其阿霉素IC50值为敏感细胞株K562/S阿霉素IC50值的169倍。本研究结果表明：亚硒酸钠具有部分逆转K562/ADR细胞对阿霉素的耐药性，呈现为浓度和时间的依赖性。这一结果与Shallom等［2］关于硒可以增加鼠耐药白血病细胞系P388/ADR对阿霉素敏感性的报道相近似，也与Caffrey等［3］报道亚硒酸钠可以提高化疗药对鼠耐药卵巢癌细胞毒性作用的结果相一致。
大量的研究表明，亚硒酸钠对敏感的白血病细胞有抑制生长和诱导凋亡的作用。李剑等［4］以急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞为研究对象，较系统进行了一系列有关细胞生长、凋亡及细胞内活性氧自由基、还原型谷胱甘肽含量的观察。发现亚硒酸钠低浓度(2 μmol/L)作用24小时后对NB4细胞生长无显著的抑制作用，5 μmol/L以上浓度可以显著地抑制NB4细胞的生长，有浓度依赖性。亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡，可能是亚硒酸钠抑制细胞生长的主要机理，同时这种作用呈时间和剂量依赖性。我们在亚硒酸钠对K562细胞和K562/ADR细胞诱导凋亡的研究中发现：亚硒酸钠可以诱导敏感细胞系K562凋亡，而这种诱导作用呈时间剂量依赖性。这与其他研究者的报道［5，6］也是一致的。
孙义民等［7］对急性白血病耐药细胞株MR2细胞系的研究发现，亚硒酸钠对细胞株的生长抑制作用呈剂量时间依赖性。亚硒酸钠作用细胞一定时间后可使胞内自由基水平增加，并在24小时时出现最大值，提示了亚硒酸钠对MR2细胞的生长抑制及凋亡诱导作用可能是通过氧化应激实现的。他们还发现，亚硒酸钠也可以增加白血病耐药细胞系K562/ADR对VCR的敏感性，使其凋亡率增加，并且也呈时间和剂量依赖性。王坤等［8］发现，低剂量硒不能诱导白血病细胞系HL?60细胞的凋亡，高剂量硒具有显著的抗肿瘤及诱导细胞凋亡的作用。1 μg/ml和2 μg/ml硒作用于HL?60细胞48小时后与对照组和低剂量加硒组相比，凋亡百分率均明显增高，这也提示硒诱导白血病细胞凋亡具有剂量依赖性。
研究发现，硒增加了VCR对敏感和耐药K562细胞系诱导凋亡的作用，总凋亡率随着作用时间和药物浓度的增加升高，其中早期凋亡率下降，而中晚期凋亡率在48、72小时两个时间段均明显上升。这提示亚硒酸钠不仅可以提高VCR诱导敏感白血病细胞凋亡，而且可以使K562/ADR细胞对VCR的敏感性增加，这种作用呈剂量和时间依赖性，而且随着作用时间的延长，细胞的凋亡逐渐由早期凋亡过渡到晚期凋亡。
相关研究发现，硒可以通过下调bcl?2，上调P53，激活Caspase等途径引起凋亡［9，10］，从而抑制肿瘤细胞的生长。一些研究发现，bcl?2基因家族蛋白表达水平的变化能显著改变肿瘤细胞株对化疗药物诱导凋亡的敏感性［11，12］。bcl?2基因为经典的凋亡抑制基因，其过度表达与白血病耐药密切相关，并且在肿瘤耐药的发生中起着重要作用。bcl?2作用于细胞凋亡途径中许多信号汇集的某个环节,并通过此环节引起细胞对化疗药物的耐受。本研究进一步表明，亚硒酸钠可下调K562/ADR细胞多药耐药基因（mdr1）及bcl?2基因的表达，该结果与Xiao等［13］和Dong等［14］报道硒制剂可下调bcl?2基因表达的结果是相一致的。据此推测亚硒酸钠可能通过下调细胞中mdr1及bcl?2基因的表达影响细胞凋亡，从而逆转K562/ADR细胞耐药性。白血病细胞多药耐药性的产生是多机制参与的，除mdr1和bcl?2基因外，可能尚有其它机制（如MRP、LRP和拓扑异构酶等）的参与，故亚硒酸钠逆转K562/ADR细胞多药耐药性的详细机制尚有待进一步探讨。
硒是人体必需的微量元素。大量的流行病学调查、体外和临床实验研究均证实它对多种肿瘤都有显著的预防作用［15］；有研究表明，硒是体内多种酶的构成成分，不同形式的硒对细胞周期蛋白激酶cdk2及蛋白激酶C有强烈的抑制作用，能诱导前列腺癌、肝癌和多种血液肿瘤细胞系的恶性细胞凋亡，能增强紫杉醇、柔红霉素等抗癌药化疗效果［16］，减少化疗药的用量，减轻化疗药的毒副作用等。Frenkel等［17］报道硒可以预防卵巢癌细胞耐药性的出现。本研究表明，亚硒酸钠可以通过下调mdr1基因和bcl?2基因，提高细胞凋亡率，达到部分地逆转K562/ADR细胞的耐药性。提高K562/ADR细胞对阿霉素的敏感性，提示亚硒酸钠可以作为一种耐药逆转剂和化疗增敏剂在抗肿瘤方面发挥作用。
【】
1栾凤君,杨纯正,马建国等.一株人红白血病多药耐药细胞系(K562/AO2)的建立及其耐药特性的研究.中华肿瘤杂志, 1993,15:101-103
2Shallom J, Juvekar A, Chitnis M. Selenium (Se) cytotoxicity in drug sensitive and drug resistant murine tumor. Cancer Biother, 1995; 10: 243-248
3Caffrey PB, Frenkel GD. Selenite cytotoxicity in drug resistant and nonresistant human ovarian tumor cells. Cancer Res, 1992; 52: 4812-4816
4李剑,左路,沈悌等.亚硒酸钠诱导人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞氧化应激和细胞凋亡.药学学报, 2002;37:677-681
5Wilke BC,Vidailhet M,Favier A, et al. Selenium?glutathione?peroxidsase(GSH?Px) and lipid peroxidation products before and after selenium supplementation.Clin Chim Acta,1992; 207:137-142
6Shi CY,Chua SC,Lee HP, et al. Inhibition of a flatoxin Bl?DNA binding and adduct formation by selenium in rats.Cancer Lett, 1994; 82:203-208
7孙义民,许彩民 ,朱圣韬等.亚硒酸钠诱导的人白血病耐药细胞株MR2的生长抑制及凋亡.基础医学与临床, 2002；22：32-35
8王坤,迟永春,王君等. 微量元素硒对HL? 60细胞凋亡的诱导及bcl?2/bax基因的表达调控.中日友好学报, 2001；15：150-154
9王晓华，魏亚明，白海等.SeO2诱导白血病细胞凋亡及对凋亡相关基因Bcl?2和p53表达调控的影响. 第一军医大学学报.2004; 24:1160-1163
10Zuo L,Li J,Yang Y, et al. Sodium selenite induces apoptosis in acute promyelocytic leukemia?derived NB4 cells by a caspase?3?dependent mechanism and a redox pathway different from that of arsenic trioxide. Ann Hematol, 2004;83:751-758
11Luzi C,Brisdelli F,Cinque B, et al. Differential sensitivity to resveratrol induced apoptosis of human chronic myeloid (K562) and acute lymphoblastic(HSB2)leukemia cells. Biochem Pharmacol,2004; 68:2091-2030
12Ou D,Wang X,Metzger DL, et al. Synergistic inhibition of tumor necrosis factor related apoptosis?inducing ligand induced apoptosis in human pancreatic βcells by Bcl?2 and X?linked inhibitor of apoptosis. Hum Immunol, 2005; 66:274-284
13Xiao R, Qiao JT, Zhao HF, et al. Sodium selenite induces apoptosis in cultured cortical neurons with special concomitant changes in expression of the apoptosis?related genes. Neurotoxicology. 2006; 2006; 27: 478-484
14Dong Y, Ip C, Ganther H. Evidence of a field effect associated with mammary cancer chemoprevention by methylseleninic acid. Anticancer Res, 2002; 22: 27-32
15Ip C. Lessons from basic research in selenium and cancer prevention. J Nutr, 1998; 128: 1845-1854
16Vadgama JV, Wu Y, Shen D, et al. Effect of selenium in combination with Adriamycin or Taxol on several different cancer cells. Anticancer Res, 2000; 20: 1391-1414
17Frenkel GD, Caffrey PB. A prevention strategy for circumventing drug resistance in cancer chemotherapy. Curr Pharm Des, 2001; 7:1595-614
