血小板衍生膜微粒对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响
作者：仲悦娇， 陈宝安， 黄成垠， 李翠萍， 高峰，费菲，裴孝平
【摘要】 本研究探讨血小板衍生膜微粒(platelet?derived membrane microparticles, PMP)对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）增殖和凋亡的影响。用不同浓度的凝血酶激活血小板释放出PMP，采用流式细胞术检测PMP的释放量，确定制备PMP时凝血酶的最佳应用浓度。以体外培养HUVEC为载体,通过噻唑蓝(MTT)实验和流式细胞术研究不同浓度的PMP对HUVEC增殖和凋亡的影响。结果表明，2、1.5、1.0和0.5 U/ml凝血酶激活血小板后PMP的释放率分别为28.7、47.7、50.1和43.9%；HUVEC的增殖与PMP呈剂量依赖关系。在培养液中添加40 μg/ml PMP时，HUVEC增殖是空白对照组的1.8±0.3倍；10 μl/ml 血管内皮细胞生长因子（VEGF）组的HUVEC增殖是空白对照组的1.9±0.5倍，两组之间无统计学差异，（p>0.05）；PMP能抑制HUVEC的凋亡，40 μg/ml PMP组的细胞凋亡率为（3.9±0.4）%,明显低于空白对照组的细胞凋亡率（9.4±0.5)%（p<0.05）。VEGF（10 μl/ml）对HUVEC细胞的凋亡无明显抑制作用,其凋亡率为（8.0±0.8）%。结论： 用1 U/ml的凝血酶刺激血小板释放的PMP较为均一，且释放量最大，可促进HUVEC细胞的增殖并抑制其凋亡。
【关键词】 细胞凋亡
Effects of Platelet?derived Membrane Microparticles on the Proliferation and Apoptosis of Human Umbilical Vein Endothelial Cells
Department of Hematology, Zhongda Hospital , Southeast University, Nanjing 210009, China; 1 Jiangsu Province Blood Center, Nanjing 210042, China
Abstract This study was purposed to investigate the effects of platelet?derived membrane microparticles (PMP) on the proliferation and apoptosis of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) . Different concentrations of thrombin were adopted to activate the platelets so as to release PMPs. Flow cytometry (FCM) was adopted to evaluate the efficiencies of different concentrations of thrombin to release PMPs. By using the HUVEC cultivated in vitro as vector, the effects of PMPs on the proliferation and apoptosis of HUVEC were investigated by MTT and FCM. The results showed that the efficiencies releasing PMPs from platelets activated by 2.0, 1.5, 1.0, 0.5 U/ml thrombin were 28.7,47.7,50.1 and 43.9% respectively; PMPs induced proliferation of HUVEC in a dose dependent manner. At the concentration of 40 μg/ml PMPs, the proliferation rate of HUVEC was 1.8±0.3 times as much as blank control, the proliferation rate in group of vascular endothelial growth factor was 1.9±0.5 times of as much as blank control, there was no statistic difference (p>0.05). The PMPs inhibited HUVEC apoptosis. Compared with the apoptosis rate of control (9.4±0.5)%，apoptosis rate in PMP group (40 μg/ml) was (3.9±0.4)% (p<0.05). The addition of VEGF (10 μl/ml) did not successfully prevented apoptosis of HUVEC with apoptosis rate of (8.0±0.8) %. It is concluded that platelets activated by 1 U/ml thrombin gets the best efficiency of PMP release, which stimulates proliferation of HUVEC and inhibits its apoptosis.
Key words platelet?derived microparticle；human umbilical vein endothelial cell； proliferation；apoptosis
血小板衍生膜微粒（platelet?derived membrane microparticles, PMP）是在血小板活化或降解过程中产生的直径为0.1-1.0 μm的小囊泡颗粒，它含有多种特异性膜糖蛋白和生物活性受体，可通过与靶细胞的相互作用启动靶细胞的生物学效应。研究表明，PMP可促进人造血干细胞、平滑肌细胞、骨细胞等的增殖。最近研究证实了血管生成因子（FGF?2和VEGF）的水平与PMP水平有着很强的相关性［1］，PMP能刺激内皮细胞增殖、迁移并影响细胞形态［2］，促进血管生成的发生和肿瘤的转移［3］，PMP有促进伤口和溃疡愈合的功能，而且不同的血小板内复合物能调控血管生成的不同阶段。本研究通过PMP与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)共同孵育观察PMP对HUVEC生长的影响。
RPMI 1640干粉系美国Gibco公司产品。小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品， EDTA（二乙烯四乙酸二钠）溶液，MTT试剂为Fluka公司产品，血管内皮细胞生长因子（VEGF）为Sigma公司产品，流式细胞仪为Bectobn Dickinson公司产品，细胞凋亡检测试剂盒为Bender Medsystems公司产品，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。
血小板膜微粒的制备
将血小板悬液经 500×g 离心10分钟（22±2℃），沉淀物悬浮于缓冲液中(9 mmol/L Na2EDTA、 26.4 mmol/l Na2HPO4、 140 mmol/L NaCl),并用缓冲液洗涤2次。最后将洗涤的血小板悬浮于Tyrode缓冲液中(137 mmol/L NaCl、12 mmol/L NaCHO3、5.5 mmol/L葡萄糖、2 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl、0.3 mmol/L NaHPO4)。调整血小板浓度为8×108/ml。分别采用2、1.5、1.0和0.5 U/ml的凝血酶激活血小板（放37℃恒温摇床上振荡30分钟）。激活后的血小板（4℃， 1600×g 离心20分钟）,上清分离于另1试管中，于4℃， 2700×g/min，离心1小时，并洗涤1次，沉淀物悬浮于Tyrode缓冲液中［4，5］。
PMP的鉴定及定量
用等量1％多聚甲醛固定PMP后采用CD61标记PMP,选择直径1 μm的微粒以确定PMP直径阈值，并设定同型对照，用流式细胞仪分析不同浓度凝血酶作用后PMP释放的情况及PMP制备的纯度。采用BCA蛋白定量试剂盒检测PMP的浓度（以蛋白含量计），操作按试剂盒说明书进行。
HUVEC的培养
人脐静脉内皮细胞ECV304(引自院上海细胞生物研究所)接种于无菌培养瓶中，加入适量RPMI 1640培养液（含10%的小牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml）,于37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养。细胞呈单纯贴壁生长，每3-5天传代1次。传代时用0.02% EDTA消化8-10分钟，用培养液吹打制成细胞悬液，按1×105浓度接种。
PMP对HUVEC增殖活力的影响
取对数生长期细胞,经0.25% 胰蛋白酶消化后，制备单细胞悬液，调整细胞密度为2×104/ ml，接种于96 孔培养板,100 μl/well，实验组加入不同浓度的PMP，另外设空白对照和10 μl/ml VEGF组，每组设3个复孔。在37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养24小时后,弃去培养液,加入5 mg/ml MTT，10 μl/well。继续培养6小时后,弃去上清液,加入二甲亚砜(DMSO) 150 μl/well,振摇10分钟,使结晶物甲月替（formazan）充分溶解,在酶联免疫检测仪上测定490 nm 处各孔的光密度值(OD 值)， 细胞增殖率。
PMP对HUVEC凋亡的的影响
取对数生长期的HUVEC，用含40 μg/ml PMP 的RPMI 1640培养液制备成细胞悬液（2×104/ ml），常规培养24小时；同时设10 μl/ml VEGF组和空白对照组。将上述培养后的细胞，经0.25% 胰蛋白酶消化，用冷PBS洗涤2遍，用50 μl 1×Annexin结合缓冲液悬浮细胞，加AnnexinV?FITC 5μl，室温避光放置10分钟，再加碘化丙锭（PI） 10 μl，混匀后室温避光放置5分钟，用冷PBS洗涤1遍，加300 μl 1×Annexin 结合缓冲液重悬细胞后， 立即在流式细胞仪上检测，以Annexin+/PI- 判断为早期凋亡，Annexin+/PI+ 判断为晚期凋亡。
统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件进行结果统计分析，实验数据用均数±标准差表示，统计方法采用方差分析，组间比较采用q检验。
结 果
凝血酶浓度的选择及PMP纯度的鉴定
PMP对HUVEC增殖的促进作用
PMP促进HUVEC增殖，并呈剂量依赖关系。当PMP为40 μg/ml时，可明显刺激HUVEC增殖，其增殖百分率为（183.3± 33.5）％，相当于加入10 μg/ml VEGF引起的细胞增殖，两者相比无统计学差异(p>0.05)(附表)。
PMP对HUVEC凋亡的抑制作用
HUVEC在加入40 μg/ml PMP，并经培养 24小时，其凋亡率为(3.9±0.4)%，而空白对照组的凋亡率为(9.4±0.5)%。两者相比有统计学差异（p<0.05）。结果还显示：VEGF（10 μl/ml）对细胞凋亡的抑制作用不明显，其细胞凋亡率为(8.0±0.8)%，虽低于空白对照组，但两者相比无统计学差异(p>0.05)(图2)。
讨 论
血小板在高切应力、胶原、钙离子载体、凝血酶、细胞因子等诱导剂的激活下，细胞膜向外伸展变形，以出芽的方式形成小泡或伪足脱落而形成的细小微粒，称为PMP血小板衍生膜微粒(platelet?derived membrane microparticles, PMP)。PMP直径 <1.0 μm，是血小板活化的标志物之一。1967 年Wolf 首先报道了PMP 的存在,将其描述为“血小板尘”(platelet dust)。PMP体积小于正常的血小板，但具有完整的膜结构,表面可表达丰富的凝血因子膜受体，为血小板进一步活化以及凝血酶原反应提供催化表面［6］。PMP除通过提供磷脂催化表面参与止血过程外，还可通过其含有多种特异性膜糖蛋白和生物学活性的受体与靶细胞相互作用，启动靶细胞的生物学效应， PMP可激活内皮细胞、多形核白细胞，促进细胞因子的分泌，内皮细胞组织因子的表达，抑制多形核白细胞的凋亡及促进细胞的趋化活性 。Hyun等［2］证实了PMP在体外有促进内皮细胞增殖、迁移、趋化和血管形成的功能。他们应用活性炭去除PMP中的脂类成份，保留蛋白质类生长因子（VEGF和 FGF?2）或用热处理PMP灭活蛋白质类生长因子成分而保留脂类成份，观察两种方法处理后的PMP对HUVEC增殖与迁移的影响。结果表明，热处理后的PMP促血管生成的能力没有明显降低，而活性炭处理后的PMP促血管生成能力明显降低。这说明，PMP的脂类成分可能是重要的活性成分，而蛋白质成分作用较小。他们还第一次证实了PMP能刺激离体的内皮祖细胞（EPC）生长，EPC 数量增加的结果表明，在创伤修复部位和一些病理状态（如肿瘤）的过程中产生的PMP与新生血管形成密切相关。Brill等［7］通过鼠主动脉环、细胞侵袭实验和琼脂糖小球移植术、人造心肌缺血鼠模型，证实了PMP在体内和体外均能促血管生成，而且在局部缺血的心肌层注射PMP可以增进慢性局部缺血的血管再形成过程。费菲等［8］曾应用Ficoll分离脐血单个核细胞（MNC），在含有100 μg/ml及50 μg/ml PMP的甲基纤维素半固体培养基中培养7-10天，观察CFU?GM集落形成情况。结果显示，PMP可促进脐血造血干细胞的增殖、黏附和归巢，故PMP在造血干细胞移植中可能具有很好的应用前景。内皮细胞是构成血管壁内膜的最基本的细胞，毛细血管管壁极薄，构造简单，主要由一层内皮细胞构成。内皮细胞在血管新生中发挥重要作用,将血管内皮细胞培养在适当的细胞外基质中,在各种促血管新生因子的作用下可以形成毛细血管样的结构和血管样结构,而加入抑制血管新生的药物可以引起网络样结构或血管样结构的破坏。因此血管内皮细胞已成为研究血管新生的发生、、影响因素及其调控机制等方面的细胞模型。本实验在体外培养条件下，观察了PMP对人脐静脉内皮细胞ECV304株增殖及凋亡的影响。结果证明，PMP可促进HUVEC的增殖，并呈剂量依赖关系, 增殖率是用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养的1.8倍，促增殖程度近似VEGF。同时，PMP可明显抑制HUVEC的凋亡，而VEGF没有明显抑制细胞凋亡的功能。PMP对血管内皮细胞的促增殖作用具有潜在的临床应用价值。
【】
1Pintucci G, Froum S, Pinnell J， et al. Trophic effects of platelets on cultured endothelial cells are mediated by platelet?associated fibroblast growth factor?2 (FGF?2) and vascular endothelial growth factor (VEGF). Thromb Haemost, 2002;88: 834-842
2Kim H, Song K, Chung JH， et al. Platelet microparticles induce angiogenesis in vitro. Br J Haematol, 2004; 124:376-384
3Honn KV, Tang DG, Chen YQ. Platelets and cancer metastasis: more than an epiphenomenon. Semin Thromb Hemost, 1992;18: 392-415
4Voermans C, van?Hennik PB, van?der?Schoot CE. Homing of human hematopoietic stem and progenitor cells: new insights, new challenges? J Hemtother Stem Cell Res, 2001;10:725-738
5Watanabe T, Dave B, Heimann DG， et al. Cell adhesion molecule expression on CD34+ cells in grafts and time to myeloid and platelet recovery after autologous stem cell transplantation. Exp Hematol, 1999;26:10-18
6Sims PJ, Wiedmer T, Esmon CT, et al. Assembly of the platelet prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane. Studies in Scott syndrome: an isolated defect in platelet procoagulant activity. J Biol Chem, 1989; 264: 17049-17057
7Brill A, Dashevsky O, Rivo J, et al. Platelet?derived microparticles induce angiogenesis and stimulate post?ischemic revascularization. Cardiovasc Res， 2005;67 :30-38
8费菲，陈宝安，黄成垠等. 血小板衍生微粒对脐带血粒?巨噬祖细胞的促增殖作用.实验血液学杂志, 2006；14: 561- 564
