HLA?B*2705重链的原核表达和活性鉴定
作者：李彦博，孙玉英，郭斯启，孙业平，张秀云，孔繁华，奚永志
【摘要】 本研究探讨HLA?B*2705重链的原核表达及活性鉴定。从HLA?B*2705全长cDNA中PCR扩增出膜外区片段并克隆进入pGEM?T载体，序列测定后构建原核融合表达载体pET32a（+）?B*2705，并转化大肠杆菌。Western Blot 和阻断抗体反应鉴定它们在体外是否具有HLA?B27抗原活性。结果表明：HLA?B*2705重链融合蛋白在大肠杆菌中获得高效融合表达，表达产量占细菌总蛋白的50%以上；通过Western Blot和阻断抗体反应鉴定它们在体外具有HLA?B27抗原活性。结论：本研究获得了HLA?B*2705重链融合蛋白，为今后的相关研究打下了基础。
【关键词】 原核表达
Prokaryotic Expression of HLA?B*2705 Heavy Chain and Identification for Its Activity
Abstract In order to investigate the expression of heavy chain of HLA?B*2705 in prokaryotic system and identify its activity, the extra?membrane gene fragment of HLA?B*2705 was amplified from full?length HLA?B*2705 cDNA by PCR and cloned into pGEM?T vector. After identification by sequencing, the prokaryotic expressing vector pET32a（+）?B*2705 was constructed. The antigenic activity of expressed protein was identified by Western blot and antibody blocking reaction. The results indicated that the fused HLA?B*2705 protein expression with high efficiency was obtained. The expressed product was more than 50% of the total bacteria protein. The antigenic activity of expressed protein was confirmed by Western blot and antibody blocking reaction. It is concluded that HLA?B*2705 fusion protein are obtained as basis for the further studies.
Key words HLA?B*2705 heavy chain; prokaryotic expression; antigenic activity
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS )是致残率较高的脊椎关节病变。脊柱炎症病变从骶髂关节逐渐上升颈椎，晚期致关节变形使患者丧失劳动能力，严重危害生活质量［1］。1973年Brewerton和Schlosstein发现HLA?B27和AS之间存在着非常强的关联性［2］。以后的许多研究结果都支持 HLA?B27与AS之间在遗传学上的联系。首先，HLA?B27与AS的关联性在世界上的许多人群中得到重复［3］；其次，B27转基因大鼠和小鼠可产生多系统自发性炎症，与AS非常相似［4，5］。关于HLA?B27分子的致病机制有多种假说，例如分子模拟假说［6］和关节源性肽（arthritogenic peptide）假说［7］等，但证据不足。最近的研究表明，HLA?B27存在多种异常形式，如缺乏抗原肽的B27?β2微球蛋白复合体、游离B27重链单体、B27重链同源二聚体等［8-10］。这些异常B27可作为自身抗原被CD4+T细胞识别［11］或作为配体被巨噬细胞表达的成对免疫球蛋白样受体（paired Ig?like receptors, PIR）［12］识别而导致AS发病。在本研究中，我们用大肠杆菌高效表达了HLA?B27抗原中的一个亚型－HLA?B*2705重链胞外区，并对其活性进行了初步研究。
材料和方法
材料
大肠杆菌DH5α由本室保存， 质粒 pET32a（+）和宿主菌origamiTM（DE3）购自Novagen公司。Tag DNA 聚合酶、pGEM?T载体连接试剂盒和质粒提取试剂盒购自Promega公司，DNA回收试剂盒购自LST公司， 小鼠抗人B*2705单克隆抗体购自Serotec公司，碱性磷酸酶标记羊抗小鼠IgG二抗试剂盒及NBT/BCIP显色试剂盒购自华美公司。
引物的设计和合成
PCR扩增引物：上游5′?GAATTCGGCTCCCACTCC ATGAGG?3′（含Nco I酶切位点）；下游5′?GCGCG CCGCTTACCATCTC?3′（ 含Not I酶切位点）。上述引物由上海生工生物工程公司合成。
cDNA获得
本室保存有HLA?B*2705全长cDNA，已经测序鉴定。PCR扩增：95℃ 预变性10分钟；96℃变性 1分钟，55℃退火 1分钟，70℃延伸 2分钟；共26个循环。DNA回收按试剂盒说明书进行。DNA片段插入T载体参照pGEM?T载体连接试剂盒说明书进行。
重组子的挑选、酶切和测序鉴定
将连接产物转化DH5α感受态菌，以IPTG、X?gal氨苄琼脂糖平板筛选，挑取白色克隆培养过夜，小量提取质粒进行Nco I和Not I双酶切鉴定。鉴定的阳性克隆送TaKaRa公司测序。
pET32a（+）? B*2705表达载体的构建
将测序鉴定正确的克隆，扩增并提取质粒。以Nco I 和Not I 双酶切并回收DNA片段。pET32a（+）空质粒也同样处理。DNA连接酶连接回收产物。将连接产物转化DH5α感受态菌，以氨苄琼脂糖平板筛选，挑取阳性克隆培养过夜并提取质粒进行Nco I和Not I双酶切鉴定。
重组子诱导表达
鉴定构建正确的表达载体转化origamiTM（DE3）感受态菌，并以卡那霉素、四环素、氨苄三抗琼脂糖平板筛选，挑选阳性克隆进行IPTG诱导表达。诱导方案：从三抗平板上挑选一克隆接种M9培养基过夜；按1∶100接种三抗M9丰富培养基，37℃摇床>250转/分钟，约3.5小时；至OD600=0.5-0.7时，加入IPTG至终浓度0.5-1 mmol/L，37 ℃摇床震摇5小时，收菌。或者，按1∶100接种后在37 ℃下培养5小时以上，至OD600 = 0.8-1.0后，将温度降至22 ℃，加入IPTG，继续培养过夜，收菌。
表达产物的SDS?PAGE电泳和Western Blot鉴定
参照分子克隆手册进行，其中Western blot鉴定用的一抗为兔抗人B*2705单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体。
表达产物的阻断抗HLA?B27抗体活性的检测
用抗HLA?B27抗血清介导的补体依赖性HLA?B27阳性淋巴细胞的细胞毒试验验证表达产物的活性。在补体存在的条件下，将从病人体内新鲜分离得到HLA?B27阳性淋巴细胞与抗HLA?B27抗血清反应，细胞将发生死亡。为考察pET32a (+)/B*2705表达产物的活性，预先将其与抗HLA?B27抗血清孵育后再加入细胞和补体，在显微镜下观察活细胞与死细胞的比例。
结 果
HLA?B*2705重链基因PCR扩增
HLA?B*2705重链基因PCR扩增后，得到960 bp的产物（图1）。
Figure 1. Electrophoresis results for the PCR products of HLA?B*2705 heavy chain.M： DNA marker. Lane 1: HLA?B*2705
表达载体的酶切鉴定
pET32a (+)/B*2705阳性克隆质粒NcoI/NotI 双酶切，获得约960 bp的B*2705的插入片段（图2）。上述表达载体是在测序正确后构建的。
诱导表达的结果
pET32a (+)/B*2705全菌在37℃及22℃诱导表达后，经变性10% SDS?PAGE结果分别见图3A和3B。在47 kD处可见一诱导表达条带。B*2705胞外区共315个氨基酸，经预测分子量大约为34.7 kD，加上融合表达的硫氧还蛋白的分子量12 kD，预期分子量大约为46.7 kD，这与我们的结果基本吻合。经凝胶扫描软件分析，在37℃及22℃诱导所得的产量分别为53.1% (图3A) 和52.4% (图3B)。
Figure 2. Double restriction of pET32 a (+)?B*2705 expression vector.M: DNA marker. Lane 1 and 2: HLA?B*2705.
Figure 3. SDS?PAGE of total bacteria protein induced for pET32a (+)/B*2705. A:protein induced at 37℃. B: protein induced at 22℃. M: protein marker. Lane 1: induced protein of total bacteria.
不同诱导条件下B*2705的表达形式
诱导表达的全菌经超声碎菌、离心后得到上清和沉淀（包涵体）。将上清与以6 mol/L尿素溶液溶解的包涵体经变性10% SDS?PAGE。结果显示，在37℃下诱导，B*2705主要出现在包涵体（图4A），而上清中几乎无表达产物；在22℃的低温下诱导，B*2705主要出现在上清（图4B）。
表达产物的Western blot鉴定
将诱导表达的全菌经超声碎菌、离心后得到上清的进行非变性PAGE，电转移至PVDF膜，经封闭、一抗及二抗作用后用NBT/BCIP试剂盒显色。结果在47 kD出现特异性条带（图5）。同时进行包涵体复性产物Western blot，不显色（数据未给出）。
表达产物的阻断抗HLA?B27抗体的活性
在抗HLA?B27抗血清介导的补体依赖性HLA?B27阳性淋巴细胞的细胞毒的试验中，100%的细胞死亡。若向此实验体系中加入1 μl诱导后的全菌破碎后的上清，90%的细胞毒反应被阻断（图6）。但是，向此实验体系中加入1 μl包涵体复性产物，未能阻断细胞毒反应（数据未给出）。
讨 论
HLA?B27抗原是一种人主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）I类分子，由6号染色体MHC区编码的α链及非MHC区编码的β2微球蛋白组成。B27实际上代表1个基因家族，包括1组等位基因，目前已经鉴定了25个等位基因及其编码的24种不同的蛋白(亚型)。这些蛋白命名为HLA?B*2701——HLA?B*2725（不包含HLA?B*2722，因为其与HLA?B*2706氨基酸序列相同） ［13］。在所有B27亚型中，B*2705分布最广，几乎见于所有人种。在B27亚型与AS相关性研究中发现，白种人AS患者B*2705亚型占绝大多数（约96%）［14］。在汉族B27阳性AS患者中B*2705占41.1%，略低于B*2704（54.8%） ［15］。
本研究中发现，在37℃及22℃下诱导，目的蛋白的产量相当，但表达形式不同。在37℃下诱导，pET32a (+)/B*2705诱导表达的产物主要存在于包涵体，而在22℃下诱导，pET32a (+)/B*2705诱导表达的产物主要以可溶形式存在于上清。包涵体用尿素溶液溶解后，即使经透析复性后，在变性及非变性SDS?PAGE后进行Western blot，仍然不能显示特异性条带，也不能阻断抗HLA?B27抗体介导的补体依赖性HLA?B27阳性淋巴细胞的细胞毒反应（数据未给出）。相反，pET32a (+)/B*2705诱导表达的上清在非变性SDS?PAGE后能被抗HLA?B27单克隆抗体识别，显示特异性条带。并且，pET32a (+)/B*2705诱导表达的上清能阻断抗HLA?B27抗体介导的补体依赖性HLA?B27阳性淋巴细胞的细胞毒反应。
在大肠杆菌上清中表达的B*2705缺乏正常人B27分子存在的糖基化，但仍能被Western blot识别，并能阻断细胞毒反应，这说明糖基化对B*2705的活性影响甚微。此外也说明，上清中可能存在使B27分子正确折叠的分子伴侣或折叠酶。而包涵体中的目的蛋白虽然含量高，但复性条件复杂，在本研究中未能取得有效复性。总之，我们获得了上清表达的有活性的HLA?B*2705分子胞外区。这为进一步研究HLA?B*2705的结构、功能、致病机制及以此为基础的药物筛选作了铺垫。
【】
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