cmpl在真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞及血小板上的表达
作者：白洁， 邵宗鸿， 施均， 贾海蓉， 孙娟
【摘要】 本研究了解真性红细胞增多症(PV)患者血小板膜及骨髓CD34阳性细胞表面TPO受体（c?mpl）蛋白及骨髓造血细胞c?mpl mRNA表达情况。应用双色流式细胞术检测13例PV患者及15名正常对照者骨髓CD34阳性细胞表面c?mpl蛋白表达；应用单色流式细胞术检测15例PV患者及15名正常对照者血小板表面c?mpl蛋白表达；应用RT?PCR方法检查PV患者及正常对照者骨髓造血细胞c?mpl mRNA的表达情况。结果表明： CD34阳性细胞c?mpl蛋白表达在PV患者为0.99％±0.14％，与正常对照（0.92％±0.12％）相比无差别（p>0.05）；血小板c?mpl蛋白表达在PV患者为20.33％±4.84％，与正常对照（23.50％±3.64％）相比无差别（p>0.05）；骨髓造血细胞c?mpl mRNA与正常组相比也无明显差别（p>0.05。） 结论： PV患者骨髓CD34阳性细胞、血小板膜c?mpl蛋白及骨髓造血细胞c?mpl的mRNA表达无明显异常。
【关键词】 真性红细胞增多症
Expressions of c?mpl Proteins on CD34+ Bone Marrow Cells and Platelets of the Patients with Polycythemia Vera
Abstract The objective of this study was to investigate the expressions of TPO receptor (c?mpl) proteins on CD34 positive bone marrow cells (CD34+ BMCs), platelets and the expression of c?mpl mRNA in bone marrow cells of the patients with polycythemia vera (PV). The expressions of c?mpl proteins on CD34+ bone marrow hematopoietic cells of 13 PV patients and 15 normal controls were assessed by bicolor flow cytometry and the expressions of c?mpl proteins on platelets of 15 PV patients and 15 normal controls were assessed by monocolor flow cytometry, and the expressions of c?mpl mRNA in bone marrow hematopoietic cells (BMHCs) were assessed by RT?PCR. The results showed that no difference was found between the expression of c?mpl proteins on CD34+ BMHCs of PV patients（0.99％±0.14％） and that of normal controls （0.92％±0.12％）（p>0.05）. There was no difference too between the expression of c?mpl protein on platelets in PV patients（20.33％±4.84％） and that in normal controls （23.50％±3.64％）（p>0.05）. No diffe?rence between the expression of c?mpl mRNA in BMHCs of PV patients and that in normal controls was seen. In conclusion, the expressions of c?mpl proteins on CD34+ BMHCs, platelets and c?mpl mRNA in BMHCs of PV patients were not obviously abnormal.
Key words polycythemia vera; platelet; bone marrow hematopoietic cell; CD34 positive; c?mpl
J Exp Hematol 2007; 15(5):1061-1064
真性红细胞增多症（PV）属骨髓性增殖性疾病（MPD），是由多潜能造血干祖细胞发生突变而引起的，其造血干祖细胞存在高增殖性及低凋亡性［1，2］。近年来的大量研究证实，PV造血祖细胞对多种细胞因子高度敏感［3-5］，说明其造血细胞表面细胞因子受体或其信号传导系统可能存在异常，因此其造血干祖细胞表面细胞因子受体及PV信号传导系统的研究有助于对其发病机制的了解。
PV患者红系祖细胞在不加外源性EPO时可以形成内源性红细胞集落（EEC）［6-8］，但多项研究证明PV患者EPO受体及EPO与配体的亲和能力是正常的，未发现EPO受体基因的异常［9］。血小板生成素（TPO）是调节血小板生成的细胞因子，其构 型上有一个153个氨基酸的结构域与EPO相似。在体外TPO不但对巨核前体细胞而且对造血祖细胞的增殖分化均产生直接作用［10，11］。实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)cmpl在真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞及血小板上的表达我们应用流式细胞术检测了15例PV患者及15名正常对照者血小板表面TPO受体（c?mpl）。应用RT?PCR方法检查PV患者及对照骨髓造血细胞c?mpl mRNA表达情况，以阐明c?mpl在PV发病机制中的意义。现将结果报道如下。
材料和方法
检测对象
2002年1月至2003年10月在中国医学院血液病诊治的PV患者15例，正常对照15名。全部患者的诊断及疗效判定依据国内统一标准［12］。15例PV患者中11例为初诊未患者，2例单纯放血治疗，2例应用羟基脲／干扰素治疗，平均治疗时间为7个月，停药2周以上且血象仍高于正常。15名正常对照，男9例，女6例，中位年龄47。15例PV患者的临床和检验指标见表1。
试剂
淋巴细胞分离液Facoll?Paque(1.077 g/ml)由中国医学科学院血液学研究所生产；兔抗人c?mpl单克隆抗体由日本麒麟公司馈赠。FITC标记羊抗兔IgG购自美国Southern Biotech公司；PE标记的CD34、IgG1抗体试剂盒购自美国Becton Dickinson公司。RNA提取试剂（TRIZOLTM reagent）由Gibco公司生产；Taq plus聚合酶、c?mpl引物，参照［6］设计，由上海生物工程有限公司合成；紫外分光光度计由美国Shimadzu公司生产；PCR扩增仪由美国FE?CETUS公司生产；紫外照相机购自日本Olympus公司；流式细胞仪(FACS) 由美国Becton Dickinson公司生产。
骨髓CD34阳性细胞表面c?mpl表达的检测
取肝素抗凝新鲜骨髓200 μl，将人AB型血清加入新鲜骨髓，孵育5分钟，封闭非特异抗体。加入兔抗人c?mpl IgG, 4℃避光孵育30分钟。用含0.5% BSA及0.6%柠檬酸钠的PBS液洗涤2遍，FITC标记的羊抗兔IgG，4℃避光孵育30分钟。加入PE标记的CD34单克隆抗体，避光4℃孵育45分钟。加入10％溶血素孵育10分钟，弃除溶血素，应用PBS洗涤2遍，加1％的多聚甲醛固定，24小时内应用流式细胞仪检测。1×106骨髓细胞加入FITC/PE标记的同型特异抗体同时孵育作为阴性对照。
血小板表面c?mpl表达的检测
取3.8%的柠檬酸钠抗凝的新鲜静脉血5 ml，以1 600×g离心10分钟，吸取取富含血小板的血浆，再以7 500×g离心12分钟，将待测血小板用含0.5% BSA及0.6%柠檬酸钠的PBS液洗涤2遍。取1×109血小板，再用含0.5% BSA及0.6%柠檬酸钠的PBS液洗涤2遍，1小时内应用流式细胞仪检测。
c?mpl表达的RT?PCR法检测
取（5-10）×106骨髓单个核细胞，应用TRIZOL一步法抽提取总RNA后应用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。C?mpl引物序列如下： c?mpl上游引物 5'?CCTACTGCTGCTAAAGTGGCAAT?3'； 下游引物 5'?CAATAGCTTAGTGGTAGGTAGGA ?3'。
PCR体系50 μl，含待测DNA 2 μl， 2.5 mmol/LdNTP 1 μl, Taq plus聚合酶2.5 U，10×缓冲液5 μl, 10 mmol/μl上游引物及下游引物各2.5 μl，加无菌双蒸水至50 μl。使用PCR扩增仪（FE?CETUS公司）扩增。C?mpl的PCR条件文献［13］为： 94℃预变性7分钟，94℃变性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸45秒，72℃再延伸5分钟，共35个循环。取10 μl扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，电压10 V/cm。应用紫外照相机（日本Olympus公司）记录结果。PCR的扩增长度应为548 bp(β?actin)、368 bp(c?mpl)。
统计学方法
率的比较采用Pearson 卡方检验或Fisher精确概率法分析；均数比较采用t检验；皆用SPSS软件处理。
结 果
骨髓CD34阳性细胞表面c?mpl表达
骨髓CD34阳性细胞表面c?mpl表达在PV患者为0.99％±0.14％，与正常对照（0.92％±0.12％）相比无差别（p>0.05）(表2）。
血小板表面c?mpl表达
血小板表面c?mpl蛋白表达在PV患者为20.33％±4.84％，与正常对照（23.50％±3.64％）相比无差别（p>0.05）（表2）。
c?mpl mRNA表达
骨髓造血细胞c?mpl mRNA 在PV患者检出率为46.7%(7/15)与正常组40%(6/15)比较无明显差别（附图）。
讨 论
近年来人们重视到PV患者巨核细胞集落（CFU?MK）对TPO高度敏感。即PV的造血干、祖细胞（CD34+细胞）在没有TPO条件下能够形成CFU?MK。因此人们认为TPO介导的信号传导系统异常可能与PV发病有关［14］。
有人报道敲除小鼠TPO受体（c?mpl）时，多潜能造血干细胞和髓系、红系定向祖细胞数均减少。若小鼠c?mpl过度表达，可导致过度造血和骨髓纤维化。c?mpl异位表达可引起致命的红细胞增多症。应用带有截短的c?mpl基因的髓系增殖性白血病病毒(MPLV)可诱导大鼠红细胞、血小板、粒细胞增多及脾大。在体外用MPLV转染造血细胞，可使造血祖细胞不依赖于生长因子而形成红细胞集落［15］。缺乏EPO受体的胚胎中，TPO可使红细胞集落形成［6］，且可以阻止去EPO受体的红系祖细胞凋亡［16］。
Dai等［3，4］报道，34名PV患者血小板均缺失c?mpl，缺失c?mpl血小板与TPO共孵育，不能激活JAK2/TYK2，以至于STAT5不能进行酪氨酸磷酸化。他们应用C末端mpl抗血清证明了PV患者中c?mpl翻译后加工过程受损。mpl胞浆外结构域第4位点缺乏翻译后糖化修饰，并认为这与其细胞内高尔基器运输缺陷有关。
Muta等［5］应用免疫杂交方法得出了不同的结论。他们发现，15名PV患者中有8名c?mpl表达水平减低，而7名表达正常。他们认为c?mpl表达水平及其功能完整性在PV患者存在异质性。
在本研究中我们发现，CD34阳性细胞、血小板表面c?mpl蛋白表达及骨髓造血细胞c?mpl mRNA表达在PV患者与正常对照者中均无差别。这表明PV患者高增殖和低淍亡与c?mpl无关，可能与细胞因子信号传导系统共同通路有关。
【】
1白洁， 邵宗鸿， 刘鸿等. 真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞淍亡及增殖特征研究. 中华血液学杂志，2004；25：195-197
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