Survivin、Bcl-2和VEGF在骨髓增生异常综合征中的表达及其相关性
作者：孙慧，马杰，孙玲，刘林湘，赵莉敏
【摘要】 本研究探讨存活蛋白（survivin）在骨髓增生异常综合征（MDS）发病中的可能作用及寻找凋亡和血管新生两种不同的机制在MDS中可能存在的联系。采用免疫细胞化学的方法检测survivin、Bcl-2和VEGF在MDS低危、高危患者和AML患者及对照者骨髓中的单个核细胞的表达情况，并分析三者间的关系。结果表明： survivin、Bcl-2和VEGF在MDS低危组、高危组和AML组的表达率和积分均逐渐增高，除Bcl-2在MDS低危组和对照组的差异无统计学意义外（P>0.05），三者在各组间的表达差异均有统计学意义（P<0.05），且三者间的表达率均呈正相关关系。结论： survivin、Bcl-2和VEGF参与了MDS的发病并与疾病病程进展有关，凋亡异常和血管新生可能通过以上3种蛋白的相互作用在MDS的发病中存在着某种联系。
【关键词】 骨髓增生异常综合征
Expressions of Survivin，Bcl-2 and VEGF in Patients with
Myelodysplastic Syndrome and Their Relationship
Abstract To determine the possible roles of survivin in the pathogenesis of myelodysplastic syndrome (MDS) and to explore the relationship between apoptosis and angiogenesis in MDS，the expressions of survivin，Bcl-2 and VEGF were detected in the BM cells of de novo patients with MDS，patients with AML and individuals of control by immunochemical staining and their relationship was analyzed.The results showed that the expression rate and integral of all the three proteins in the low-risk group of MDS，high-risk group of MDS and de novo acute myeloid leukemia patients gradually increased，in addition to expression of Bcl-2 in low-risk group of MDS and control group.The significant differences were observed in every two groups and there were positive relations between the every two proteins.It is concluded that survivin，Bcl-2 and VEGF are all involved in the pathogenesis of MDS，and related with the progression of this disease，the deregulated apoptosis and angiogenesis may be involved in the pathogenesis of MDS through interaction among three proteins mentioned above.
Key words myelodysplastic syndrome; survivin; Bcl-2; VEGF
Survivin是凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族的一员，是一类新的抑制凋亡的调节分子，在多种实体瘤中表达上调，并与肿瘤的凋亡、增殖、血管新生及其预后和耐药性的产生有密切关系，survivin在多种恶性血液病中大多或全表达，且与疾病的预后和进展有关。凋亡的异常改变和血管新生均被认为参与了骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）的发病。在其它系统肿瘤中，已有研究显示二者可能存在一定关系。有关survivin在MDS中的表达情况报道较少，且研究结果不甚一致［1，2］，本研究通过检测survivin、Bcl-2和VEGF在MDS中的表达情况，旨在探讨survivin这一新的凋亡调节分子在MDS发病中可能起的作用并寻找凋亡异常和血管新生在MDS中可能存在的联系。
材料和方法
病例选择
所有病例均为郑州大学第一附属血液科门诊及住院患者和河南省人民医院血液科、郑州市第三人民医院血液科2003年6月-2003年10月的门诊患者。所有病例的诊断都依据《血液病诊断及疗效标准》［3］。将患者分为3组：① 低危组：按FAB分型标准中的难治性贫血（MDS-RA）、难治性贫血伴环形形铁粒幼细胞（MDS-RARS）17例（男性6例，女性11例，平均年龄39.8岁），MDS-RA 16例，MDS-RARS 1例；②高危组：按FAB分型标准的初治的难治性贫血伴原始细胞过多（MDS-RAEB）、转化性难治性贫血伴原始细胞过多（MDS-RAEB-t）和慢性粒-单核细胞白血病（CMML），共14例（男性8例，女性6例，平均年龄47.0岁）；MDS-RAEB 9例，MDS-RAEB-t 4例，CMML 1例；③急性髓细胞白血病组（AML组）：按FAB分型标准的初治白血病患者15例（男性10例，女性5例，平均年龄36.8岁），其中M2 7例，M3 2例，M4 3例，M5 2例，M1 1例。另有对照组10例，其中男性4例，女性6例，平均年龄32.7岁。
细胞滴片的制备
取患者及正常人骨髓0.8-1 ml，用2% EDTA抗凝，4℃冰箱保存，1-4小时内用淋巴细胞分离液密度梯度离心，分离骨髓单个核细胞（BMMNC），制备细胞滴片，进行免疫细胞化学检测。
免疫细胞化学检测
制备好的细胞滴片依次进行以下步骤： 40 g/L的多聚甲醛室温固定30分钟，以3％过氧化氢溶液室温孵育10分钟，正常封闭，用羊血清室温孵育15分钟，加兔抗人survivin（福建迈新公司产品，1∶100稀释）、小鼠抗人Bcl-2和小鼠抗人VEGF（均为北京中山公司产品，1∶100稀释），置4℃过夜，滴加生物素标记羊抗兔二抗和羊抗小鼠二抗，37℃孵育10分钟，辣根过氧化物酶（HRP）标记链酶卵白素，37℃孵育10分钟，每步之间均用PBS洗涤，最后经DAB显色，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
结果判定
细胞胞浆着棕黄色者为阳性细胞。根据阳性颗粒所占的比例及显色程度，参照1997年全国免疫组织化学技术诊断标准化专题研讨会意见，对阳性细胞进行积分： 1分――阳性颗粒所占细胞面积的比例<50％，细胞浆和（或）核内见浅黄色颗粒，明显高于背景底色；2分――阳性颗粒所占细胞面积的比例为51％-70％，细胞浆和（或）核内见较深黄色颗粒；3分――阳性颗粒所占细胞面积的比例>70％，细胞浆和（或）核内见大量深黄色颗粒，浆和（或）核有时可被颗粒掩盖而不显。每片统计200个细胞中的阳性细胞数及阳性积分。
统计学处理
所有数据均以均数±标准差( ±SD)表示，应用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，多样本均数的比较采用方差分析，并进行直线相关性检验，以α＝0.05为显著性检验水准。
结 果
Survivin在各组骨髓细胞中的表达
低危组、高危组和AML组骨髓细胞中survivin表达率和积分依次增高，各组间差异均有统计学意义（P<0.05）(表1)(图1-4）。Table 1.Survivin expression in low risk MDS，high risk MDS，AML and control groups (略)
各组骨髓细胞中Bcl-2的表达
Bcl-2表达率和积分在低危组、高危组和AML组骨髓细胞中依次增高，低危组与对照组之间的差异无统计学意义（P>0.05），其余各组间的差异均有统计学意义（P<0.05）(表2)(图5-7）。Table 2.Bcl-2 expression in low risk MDS，high risk MDS，AML and control groups (略)
VEGF在各组骨髓细胞中的表达
低危组、高危组和AML组骨髓细胞中VEGF表达率和积分依次增高，各组间的差异均有统计学意义（P<0.05）(表3)(图8-10)。Table 3. Expression of VEGF in low risk MDS，high risk MDS，AML and control groups (略)
Survivin、Bcl-2和VEGF间的相关关系
低危组、高危组、AML组及对照组骨髓细胞中蛋白survivin与Bcl-2、survivin与VEGF及Bcl-2与VEGF的表达率均呈正相关（相关系数r分别为0.713、0.746和0.715，P<0.05）(图11-13)。
讨 论
迄今MDS的发病机制不明，但多数人认为MDS的发生和演进是多种致病因素共同作用的结果，癌基因的激活、抑癌基因的失活、凋亡（apoptosis）的异常改变、血管新生及微卫星序列不稳定性在MDS的发生和演进中均可能发挥一定作用。早期有关MDS中凋亡的研究集中在Bcl-2家族，多数研究显示早期MDS中促凋亡/抗凋亡蛋白比值显著高于晚期阶段［4，5］，在Bcl-2家族成员中，Bcl-2的表达在RAEB、RAEB-t、CMML组和RA和RARS组中差别最明显，前者中的表达高于后者［6］。本研究结果显示，Bcl-2表达率和积分在低危组、高危组和AML组骨髓细胞中依次增高，低危组与对照组之间表达无显著性差异（P>0.05），其余各组间表达均有显著性差异（P<0.05），与多数相关研究结果较为一致。Bcl-2位于线粒体内膜，在维持线粒体电位中起重要作用，因而通过凋亡的线粒体通路，即通过干扰细胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）的释放而阻断caspase酶的激活。而新近发现的凋亡调控家族IAP家族中最小的一员survivin抗凋亡作用可能有以下几方面： ①在caspase的凋亡途径中，survivin是caspase-3、caspase-7的抑制剂，而后二者是多种刺激诱导凋亡的共同通路，因而survivin可通过抑制caspase活化的两条途径来抑制凋亡； ②survivin通过与CDK4相互作用形成survivin/CDK4复合体，使CDK2/cyclin E激活、Rb磷酸化，导致p21从其与CDK4的复合体中释放出来，并与线粒体的procaspase-3作用以抑制Fas介导的凋亡；③非caspase依赖的途径，如参与调节p53依赖的凋亡。目前关于survivin在MDS中的表达情况及其意义报道较少。本组结果发现MDS低危组、高危组和AML组骨髓细胞中survivin表达率和积分依次增高，各组间表达均有显著性差异（P<0.05）并显著高于对照组（P<0.05）。survivin基因位于染色体17q25，bcl-2基因位于染色体18q21，二者都被富含GC而缺少TATA的启动子所调控，并都在增生活跃的细胞中转录，提示它们在转录激活上拥有共同的或相似的机制，即可能是转录水平的调节导致了两个基因在肿瘤中的共表达。分析Bcl-2和survivin表达率的相关性发现，在MDS患者BMMNC中，Bcl-2和survivin的表达存在正相关（相关系数r＝0.726），提示二者可能通过调控细胞凋亡而在MDS的发病中存在相互作用。Badran等［1］用RT-PCR方法检测survivin发现，12例RA患者中的11例(91.6%)和 3例RAEB-t患者(100%)有survivin表达，且大多病例表达水平较高。但是在4例CMML患者未测到survivin表达，而RA患者survivin的表达水平和频率高于AML患者。虽然survivin的表达在AML患者中被认为是一个独立的不良预后因素，然而对于MDS患者中具有高水平survivin的MDS-RA患者并不一定有不良的预后。蔡真等［2］用RT-PCR检测结果显示，MDS患者survivin mRNA总阳性率高于正常对照组，高危组（RAEB、RAEB-t、CMML）阳性率高于低危组，即随着MDS的进展，survivin mRNA的表达率随之增高，作者认为survivin在MDS的进展过程中起重要作用。本研究结果有关Survivin在MDS中的表达趋势与蔡真等的结果较为一致，但发现Survivin这一抗凋亡蛋白在低危组MDS的骨髓细胞中表达较高，与对照组间有显著性差异，与Badran等［1］发现的RA患者中survivin亦有较高的表达相似。这提示在MDS的发病中survivin的作用可能并不仅仅与其抗凋亡作用相关，还可能存在着其它的作用机制。同时检测血管内皮生长因子（VEGF）这一最重要的血管新生促进因子，发现MDS患者骨髓细胞中VEGF高表达，而在低危组、高危组、AML组和对照组骨髓细胞中VEGF表达率和积分依次增高，各组间表达均有显著性差异（P<0.05），且各组骨髓细胞中蛋白Survivin与VEGF的表达率呈正相关（r＝0.746），并且Bcl-2与VEGF的表达率也呈正相关（r＝0.742）。近来的研究显示，对于新生的内皮细胞VEGF也是一个主要的存活/抗凋亡因子，这一功能和其增强血管渗透性的作用被认为是其促血管新生的主要途径［7］。Tran等［8］发现，survivin参与了人脐静脉内皮细胞中VEGF介导的抗凋亡作用，从而促进血管新生。Dias等［9］研究显示，VEGFR＋（flt-1或KDR或二者均表达）的白血病细胞系和原代白血病细胞受VEGF刺激后，其Bcl-2表达水平亦明显增高，在VEGFR＋的白血病细胞，VEGF通过与KDR的相互作用诱导HSP-90表达，后者又与Bcl-2和凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptosis protease-activating factor-1，Apaf-1）结合，从而阻止procaspases-9的活化而抑制凋亡［9］。由此可见，在白血病细胞中VEGF同样具有促生存/抗凋亡作用，该作用的发挥与Bcl-2相关。研究表明MDS患者部分骨髓细胞膜上也同时表达Flt和KDR［10］，因而推测MDS患者骨髓细胞内的VEGF、Bcl-2和survivin可能通过相互作用促进MDS恶性克隆的增殖，抑制凋亡，促进疾病进展。
总之，本组结果提示凋亡异常和血管新生在MDS的发病中可能并不是完全独立的因素，二者可能通过Survivin、Bcl-2和VEGF的相互作用在MDS的发病中存在着某种联系。
【】
1Badran A，Yoshida A，Wano Y，et al.Expression of the anti-apoptotic gene survivin in myelodysplastic syndrome.Int J Oncol，2003; 22：59-64
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