CD117/CD11b在急性早幼粒细胞白血病不同病期的表达变化
作者：沈红强，汤永民，宋华，石淑文，杨世隆，徐卫群，钱柏芹
【摘要】 为了了解CD117/CD11b在急性早幼粒白血病细胞初诊及后的表达变化，探讨其表达变化对APL诊断和预后的意义，采用CD45/SSC双参数散点图设门方法进行三色或四色流式细胞术细胞表面及浆内分化抗原分析，应用RT-PCR技术检测骨髓中PML/RARα融合基因的mRNA表达。结果表明： APL与CML慢性期都高表达MPO、CD13和CD33，而几乎不表达CD34、HLA-DR及T，B淋巴系列标志。有14.5%的APL患者表达CD56，有48.2%的APL患者表达CD15，CD15在APL的表达明显低于CML慢性期（48.2% vs 95.2%，P<0.01）。有78.3%的APL患者表达CD117，而在CML慢性期不表达CD117。CD11b在APL的表达率仅为16.9%，而在CML慢性期几乎都表达CD11b。有72.3%的APL患者呈CD117+CD11b-表型，而在CML慢性期患者细胞中均未见此表型，它几乎均呈CD117-CD11b+表型。11例表型为CD117+CD11b-的APL患者经治疗获完全缓解，在2个月以后CD117阳性细胞百分率均小于5%，同时细胞高表达CD11b，呈CD117-CD11b+表型。检测31例APL患者PML/RARα融合基因，25例该融合基因阳性，阳性率为80.6%，其中16例（64%）为PML/RARα基因 L型，9例（36%）为S型。16例PML/RARα融合基因 L型APL患者CD117表达有14例（87.5%），9例S型CD117表达有4例（44.4%），6例PML/RARα融合基因阴性APL患者CD117表达有2例（33.3%）。结论： CD117/CD11b表型分析有助于APL与其它AML亚型及CML慢性期细胞的鉴别，CD117+CD11b-表型有助于APL细胞和APL患者缓解恢复期的良性髓系增生细胞的区分，对APL患者的治疗方案选择、预后判断以及发病机理的研究等均有重要价值。
【关键词】 CD117/CD11b; 急性早幼粒细胞白血病；免疫表型； 流式细胞术； PML/RARα融合基因
Expressions of CD117 and CD11b in Patients with APL at Dignosis and Post-Treatment
Abstract The aim of this study was to evaluate the value of CD117/CD11b phenotypic analysis to diagnosis and prognosis of acute promyelocytic leukemia (APL). Three-or four-color flow cytometry with a series of 22 monoclonal antibodies and CD45/Side Scatter (SSC) gating strategy were used to identify immunophenotypic characteristics of APL as compared to CML in chronic phase (CML-CP). PML/RARα fusion gene was detected by using reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. The results showed that MPO，CD13 and CD33 were almost expressed in all patients with APL and CML-CP whereas HLA-DR and CD34，the hematopoietic progenitor cell markers，were rarely expressed. The positive rate of CD15 in APL was significantly lower than those in CML-CP (P<0.01). CD117 was positive in 78.3% of the APL cases and in none of the cases of CML-CP. On the other hand，CD11b was almost postive in all cases of CML-CP，but only 16.9% of the APL cases were found positive for this antigen. The CD117+CD11b-phenotype was present in 72.3% of APL cases while none of cases with CML–CP with this phenotype. Almost all of the cases with CML-CP had the phenotype of CD117-CD11b+. CD117-CD11b+ phenotype was detected in all patients recovering from APL with CD117+CD11b-phenotype at diagnosis and after treatment with all-trans-retinoic acid (ARTA) for 2 months. PML/RARα fusion gene was positive in 80.6% (25/31) of the APL cases，of which，64％ of the cases belonged to the type L while only 36% of the cases were showed type S for this fusion gene. The positive rates of CD117 were 87.5%，44.4% and 33.3% in type L group，S group and negative group respectively. It is concluded that analysis of both CD117 and CD11b phenotype may be helpful to the diagnosis，therapy and prognosis of APL in children and adults and to differentiation of APL from recovering benign myeloid proliferation.
Key words CD117/CD11b; acute promyelocytic leukemia; immunophenotyping; flow cytometry; PML/RARα fusion gene
急性早幼粒细胞型白血病（APL或M3）是急性髓细胞性白血病（AML）中的一种特殊类型，其临床表现及治疗方案有别于其它类型的AML，极易发生弥漫性血管内凝血（DIC），全反式维甲酸（RA）诱导缓解治疗有很好的疗效［1］，因而早期快速正确诊断APL对及时选择合适的治疗方案至关重要。目前对其的诊断和预后判断主要依靠临床表现和骨髓、血液细胞的形态学变化。流式细胞术（FCM）免疫表型分析已成为急性白血病诊断和分型的重要工具之一，它能为临床诊断APL和预后判断提供重要的补充信息。近6年来，我们应用三色或四色FCM CD45/SSC双参数散点图设门方法对1999年11月至2005年9月来本院就诊和外院送检的83例APL患者的白血病细胞进行了较全面的免疫表型检测，分析了CD117/CD11b在APL细胞初诊及治疗后的表达变化，探讨其表达变化对APL诊断和指导治疗的意义，并与慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP)的免疫表型进行了比较，现将结果报告如下。
材料和方法
病例选择
1999年11月-2005年9月来本院就诊的及外院送检细胞表面标记检查的病例按FAB标准诊断为APL的共83例，接受检查时骨髓早幼粒细胞占30%-97%。83例中儿童41例，成人42例，男45例，女38例，中位年龄24岁。CML慢性期患者 21例，接受检查时骨髓中幼粒细胞及晚幼粒细胞占30%-65%，其中儿童13例，成人8例，男14例，女7例，中位年龄15岁。
标本
化疗前采骨髓，肝素钠抗凝。用磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）稀释成有核细胞浓度为107/ml的细胞悬液备用。
白细胞免疫表型检查
按多色直接免疫荧光标记法进行染色［2］。染色前，按106细胞/100微升细胞的比例加AB型血浆，4℃培养20分钟，以阻断Fc受体。所用标准单克隆抗体（McAb）包括FITC、PE、PerCP或APC标记的CD10、CD19、CD20、CD22、CD2、CD3、CD7、CD56、CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33、CD41a、CD34、CD117、CD38、CD45、HLA-DR、免疫球蛋白轻链κ、λ链等，均购自美国Becton Dickinson公司。胞浆内MPO、CD22和CD3的检测首先用1%的多聚甲醛固定，后加透膜剂，再进行三色直接免疫荧光标记法染色。用FACSCaliburTM流式细胞仪（Becton Dickinson）和CellQuest软件获取并分析10 000个细胞。通过CD45/SSC设门识别高侧散射（SSC）细胞群，再分析该细胞群各白血病相关抗原的表达。各样本均与4种荧光素标记的无关同型Ig亚类（均购自美国Becton Dickinson公司）作为阴性对照。结果判断以细胞表面抗原表达≥20%为阳性。
分子生物学检测
应用RT-PCR技术检测骨髓中PML/RARα融合基因的mRNA表达。取患者骨髓标本经Ficoll-Hypaque密度梯度离心后，分离单个核细胞（MNC），洗涤后以TRIZOL一步法提取总RNA，进行逆转录反应。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，利用Syngene凝胶成像扫描仪观察结果。
统计学分析
用SPSS 10.0软件包进行相关分析，χ2检验，P<0?05具有统计学意义。
结 果
APL与CML慢性期免疫表型特点
早幼粒细胞在CD45/SSC双参数设门散点图中所处的区域见图1左上图，图中R1区为CD45/SSC双参数设门散点图中早幼粒细胞的所在区域，此区域通常还混杂有中幼粒及晚幼粒细胞，无明显的分界。此区域一般有较高的SSC，有别于原始粒细胞。CD45荧光强度弱于单核细胞。图中显示1例APL和CML慢性期细胞在CD45/SSC双参数设门散点图中处于相同区域，APL表型为CD117+CD11b-，而CML慢性期则为CD117-CD11b+。附表显示，APL与CML慢性期都高表达MPO、CD13和CD33，而几乎不表达CD34、HLA-DR及T、B淋巴系列标志。有14.5%的APL表达CD56。有48.2%的APL患者表达CD15，CD15在APL的表达要明显低于CML慢性期（48.2% vs 95.2%，P<0.01）。有78?3%的APL患者表达CD117，而CML慢性期不表达。CD11b在APL的表达率仅为16.9%，而在CML慢性期的表达率为95.2%(P<0.01)。有72?3%的APL细胞呈CD117+CD11b-表型，而此表型在CML慢性期不存在，它们几乎均呈CD117-CD11b+表型。APL另仅有10.8%、6.0%和10.8%分别为CD117-CD11b+、CD117+CD11b+和CD117-CD11b-表型，明显低于CD117+CD11b-表型(P<0.01； P<0.01； P<0.01)。
APL患者初诊与缓解后免疫表型特点比较
11例表型为CD117+CD11b-的APL患者经治疗开始后1、2、3、4个月时检测骨髓细胞CD117抗原表达共44例次，其中2个月以后CD117阳性细胞百分率均小于5%，同时细胞高表达CD11b，即均表现为CD117-CD11b+的免疫表型，骨髓形态学变化表明均已缓解。图2为1例APL治疗前后CD117的表达情况。图3为11例APL治疗前后CD117的表达情况。Table . Immunophenotype of APL and CML-CP（略）
APL患者免疫表型与PML/RARα融合基因表达
关系
在83例APL患者中对31例（14例成人和17例儿童）进行了PML/RARα基因检测，结果25例患者PML/RARα融合基因阳性，阳性率为80.6%，其中16例（64%）为PML/RARα基因 L型，9例（36%）为S型。16例PML/RARα融合基因 L型APL患者CD117表达有14例（87.5%），9例S型CD117表达有4例（44.4%）(P=0.058)，6例PML/RARα融合基因阴性APL患者CD117表达有2例（33.3%）。
讨论
急性早幼粒白血病细胞群在FCM CD45/SSC双参数设门的散点图上因其胞浆颗粒较多表现为较高的侧散射和中等的CD45荧光强度，结合白血病细胞早期抗原检测如CD34、HLA-DR等而容易与其它AML亚型细胞如原粒细胞和单核细胞区别开来。但急性早幼粒白血病细胞群在FCM CD45/SSC（线性或对数）双参数设门的散点图上的区域因与中幼粒、晚幼粒细胞并无明显的分界而不易鉴别，因此对此区域内全部细胞设门用单克隆抗体标记分析来区分比较客观。由于CML慢性期患者骨髓中以中幼粒、晚幼粒细胞增多为主（在非红系细胞中比例一般大于30%），故本研究在多色流式细胞术分析APL细胞免疫表型特点的同时比较了CML慢性期患者骨髓细胞的免疫表型，从而有助于对APL细胞免疫表型特点的理解。
在FCM CD45/SSC双参数设门的散点图上，早幼粒白血病细胞群SSC高度（以平均值Mean为单位）一般在50以上，可明显区别于原粒细胞，CD45荧光强度弱于单核细胞，高表达MPO、CD13、CD33和CD117，其次为CD15，CD11b表达率较低，仅为16.9%。APL部分患者（14.5%）表达CD56，Ito等［3］报道CD56+ APL患者容易复发，缓解期较短，无病生存率低，我们先前亦有类似的报道［4］。除了极少部分APL患者表达CD2外，其余T、Ｂ及巨核细胞系列标志均阴性。CD34和HLA-DR在APL患者表达率极低，分别仅为3.6%和2.4%。而两者一般在M0/M1、M2、M4和M5均有较高的表达［2］，这有助于与APL的鉴别诊断。
由于APL细胞在CD45/SSC双参数设门的散点图模式类似于正常早幼粒，中、晚幼粒细胞，且免疫表型通常均为CD34-及HLA-DR-，其它常见的髓系标志如MPO、CD13、CD33表达相似，这给正确鉴别APL细胞增加了困难。CD117是一种由c-kit 原癌基因编码的分子量为145 kD的跨膜蛋白受体，其配体为干细胞因子（SCF）。SCF 是重要的造血生长因子，与其他细胞因子协同作用可刺激造血干/祖细胞的增殖和分化。Bene 等［5］报道CD117在正常骨髓细胞的阳性率<5%，多在干细胞、髓系定向祖细胞上表达。我们先前的报道表明，CD117主要表达在M0/M1、M2、M3及M5患者细胞上，在正常骨髓细胞的阳性率均<4%［6］。本研究数据表明，CD117在APL患者的阳性率为78.3%，而在CML慢性期患者不表达，这表明CD117在中幼粒细胞和晚幼粒细胞上是不表达的。CD11b是细胞黏附分子整合蛋白家族成员之一MAC-1（CD11b/CD18）的α链，分子量为160 kD。正常情况下，它主要在成熟单核细胞、杀伤细胞、中性粒细胞上表达，其主要功能是促进炎症的发生和，激活淋巴细胞，促进吞噬细胞的吞噬功能等，在机体的抗感染免疫中发挥重要作用［7］。本研究资料显示，CD11b在APL患者中表达较低，为16.9%，而在CML慢性期患者几乎全部表达，表明CD11b在中幼粒细胞和晚幼粒细胞上是表达的。83例APL患者表型多数（72.3%）表现为CD117+CD11b-，而表型为CD117-CD11b+、CD117+CD11b+及CD117-CD11b-分别仅为10?8%、6.0%和10?8%。而CML慢性期患者几乎均呈CD117-CD11b+表型，未见CD117+CD11b-表型。可见在CD34和HLA-DR均阴性的情况下，CD117+CD11b-表型是诊断APL的重要指标。Rizzatti等［8］利用此表型区分APL和急性粒细胞缺乏症。
本研究表明，具有CD117+CD11b-表型的APL，在经治疗缓解后细胞表型转变为CD117-CD11b+。Rizzatti等［8］亦认为，此特点有助于APL细胞与APL患者缓解恢复期的良性髓系增生细胞的区分。可见CD117+CD11b-表型可作为监测APL残留白血病细胞的指标之一。
APL具有特征性t(15;17)(g22;q12)染色体改变，导致17号染色体上的RARα基因和15号染色体上的PML基因并置，产生了PML/RARα融合基因，该融合基因是APL细胞的特异性分子标志。近年研究报道认为，该融合基因检测在APL诊断与预报复发上具有重要的价值［9］。本研究发现，PML/RARα融合基因阳性检出率达80.6%。根据我们的初步结果显示，CD117在PML/RARα融合基因 L型APL患者表达较高，而在S型及PML/RARα融合基因阴性患者表达较低，但尚无统计学意义，可能与PML/RARα S型及融合基因阴性者病例数较少有关，拟进一步积累病例进行深入研究。
致谢： 本研究中成人骨髓形态学诊断经浙江大学医学院附属第一骨髓室童向民副主任医师复核，特此表示感谢。
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1 Sun GL，Ouyang RR，Chen SJ，et al. Treatment of acute promyelocytic leukemia with all-trans retinoic acid. A five-year experience. Chin Med J (Engl)，1993; 106 :743-748
2 沈红强，汤永民，杨世隆等. 多色流式细胞术在222例儿童急性白血病免疫分型中的应用. 中华儿科杂志，2003; 41:334-337
3 Ito S，Ishida Y，Oyake T，et al. Clinical and biological significance of CD56 antigen expression in acute promyelocytic leukemia. Leuk Lymphoma，2004; 45: 1783-1789
4 张瑛，汤永民，杨世隆等. CD56在急性白血病中的表达及其临床意义. 实验血液学杂志，2002; 10: 187-190
5 Bene MC，Bernier M，Casasnovas RO，et al. The reliability and specificity of c-kit for the diagnosis of acute myeloid leukemias and undifferentiated leukemias. The European Group the Immunological Classification of Leukmias (EGIL). Blood，1998; 92: 596-599
6 沈红强，汤永民，杨世隆等. CD117在白血病细胞上的表达分析. 中华血液学杂志，2003; 24: 228-230
7 Tan SM，Hyland RH，Al-Shamkhani A，et al. Effect of integrin beta 2 subunit truncations on LFA-1 (CD11a/CD18) and Mac-1 (CD11b/CD18) assembly，surface expression，and function. J Immunol，2000;165:2574-2581
8 Rizzatti EG，Garcia AB，Portieres FL，et al. Expression of CD117 and CD11b in bone marrow can differentiate acute promyelocytic leukemia from recovering benign myeloid proliferation. Am J Clin Pathol，2002; 118:31-37
9 张晓晖，乔振华，杨林花等. 急性早幼粒细胞白血病PML/RARα融合基因研究及其临床意义. 中华内科杂志，2000; 39:31-33.
