人胚胎造血的AGM区基质细胞基因表达谱分析
作者：付劲蓉，陈惠芹，张绪超，黄绍良，周敦华，黄科
【摘要】 为了筛选在主动脉-性腺-中肾（AGM）区基质细胞中差异表达的基因，以药物流产的孕30-35天的人胚胎AGM区来源基质细胞为“实验方”，以源自意外而致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织的基质细胞为“驱动方”，建立了在人AGM区基质细胞中差异表达基因的消减杂交文库。进一步用基因芯片技术对所建立的抑制消减杂交文库进行筛选，并挑选其中明显差异表达的18个克隆进行序列测定和同源性分析。结果表明： 在所构建的AGM抑制消减杂交文库中，经过PCR鉴定有特异性扩增带且扩增带分子量在200-700 bp的克隆有211个，阳性率高达76.4％。经过基因芯片筛选，挑选出ratio值大于5的克隆共18个进行序列测定显示，在测序的18个明显差异表达的阳性克隆中，4个为未知基因，14个为已知基因，其中这些已知基因分别参与了细胞迁移、分化、生长、细胞周期、信号转导及血管发生等细胞重要生命过程。这些基因大多数在胚胎分化造血发育中的作用尚未见报道。结论 筛选AGM区基质细胞中差异表达的基因为进一步研究胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供了必要的理论基础。
【关键词】 AGM区；胎肝；基质细胞；抑制消减杂交；基因芯片
Screening and Cloning the Genes Differentially Expressed in Human Embryonic AGM-Derived Stromal Cells
Abstract To screen and separate the genes differentially expressed in human embryonic aorta-gonad-mesonephros(AGM)-derived stromal cells，a subtracted library was generated through the suppression subtractive hybridization using the cDNA of human embryonic AGM-derived stromal cells as target and human fetal liver(FL)-derived stromal cells as drivers. Then a high though screening technique，gene chip，was used to screen the differentially expressed genes in the established subtractive library. Approximately 18 of the resulting subtracted cDNA clones were partially sequenced and analyzed by blastn in the GenBank database. The results showed that 211 Clones were selected and identified from the established subtractive library，the positive ratio was amount to 76.4%. 18 over-expressed genes were screened by gene chip with more than a 5-fold difference expression levels between AGM and FL-derived stromal cells，and were selected to sequence，results of sequencing indicated that the 18 sequences was compared to known sequences in the GenBank database， and among the sequenced clones，14 sequences were considered as part of the known genes，and 4 sequences representing previously unknown genes. The known gens were reported to involve the regulation of cell migration，cell differentiation，cell proliferation，cell cycle，signal transduction，and angiogenesis. Most of these genes have not been reported to relate to the haematogenesis in ontogeny. It is concluded that many genes both known and unknown are differentially expressed in human embryonic aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cells. Discovery of these genes provides a solid foundation to elucidate the mechanism of haematogenesis in ontogeny.
Key words AGM region; fetal liver; stromal cell； suppression subtractive hybridization; gene chip
主动脉-性腺-中肾（aorta-gonad-mesonephros，AGM）区近年来被认为是永久造血干细胞（definitive HSC）出现的最早区域，为胚胎造血发生提供了必要的启始条件［1］，正成为国际上造血分化机理研究中的热点［2，3］，但其具体的分子机制仍不清楚。本研究建立了人AGM及胎肝（fetal liver，FL）基质细胞的抑制消减杂交文库，为阐明胚胎造血发育的分化调控的分子机理提供线索。
材料和方法
主要试剂
IMDM培养基及胎牛血清均购自Gibco公司。总RNA提取试剂TRIZOL购自上海生工公司。mRNA分离试剂盒-Oligotex mRNA kit购自德国Qiagen公司，抑制消减杂交试剂盒PCR-Select TM cDNA subtraction kit购自购自美国Clontech公司。A-T clone试剂盒InsT/AcloneTM PCR product kit购自立陶宛Fermentas公司。大肠杆菌JM109购自大连TaKaRa Biotech公司。
基质细胞
按照本室方法建立的人AGM区基质细胞（hAGMS3）［4］，在含15%的胎牛血清的IMDM中传至第6代，用于实验；人胎肝基质细胞取自因意外致流产的孕4-5月的水囊引产的胎儿肝组织，用胰蛋白酶消化法获得基质细胞，传至第6代用于实验。
AGM及FL基质细胞的鉴定
采用流式细胞仪检测细胞膜表面分子CD34、CD45、CD14、CD44、CD29、CD105的表达。
AGM基质细胞抑制消减杂交文库的建立
利用Clontech公司PCR-SelectTM cDNA subtraction kits，以FL基质细胞细胞作为“驱动方（driver）”，AGM基质细胞作为“实验方（tester）”进行抑制消减杂交，将两次消减杂交的产物经过两轮PCR反应扩增后，利用Fermentas IinsT/AcloneTM PCR product kit将其克隆到PUC57/T 载体，经过蓝白斑筛选，挑选白色菌落（阳性克隆）即获得HL-60/DNR抑制消减杂交文库。
抑制消减杂交文库的基因芯片筛选
将抑制消减杂交文库中的211个阳性克隆经PCR扩增后，纯化产物，并与一定量的植物基因（排除外源性污染）、管家基因（作为阳性质控及两种荧光信号强度的校准）、空白对照组成324阵列，利用Cartesian Psys5500芯片点样仪以针点（pin printing）的形式将每个克隆有序地点在氨基化修饰的载波片上。然后分别与cy3及cy5荧光信号标记的AGM及FL基质细胞的cDNA探针进行杂交，经过不同严谨度的洗片，激光共聚焦扫描仪读取荧光信号，利用ImaGene软件包进行扫描信号分析，进而确定各个克隆所代表的基因在AGM及FL两种基质细胞中的相对表达强度，共制作4张芯片以利于信号综合分析。
差异表达基因克隆序列的测定
选取在AGM中呈明显差异表达（基因芯片ratio值大于5）的18个克隆进行序列测定。由大连宝生物公司协助完成。所用测序引物为克隆载体pUC57/T多克隆位点上游通用引物序列M13-47即CGCCA GGGTT TTCCC AGTCA CGAC，由大连宝生物公司合成。测序反应试剂为ABI PRISM(r) Big DyeTMterminator cycle sequencing ready reaction kit with amplitaq DNA polymerase （Applied Biosysterms），测序仪为ABI PRISMTM377XLL DNA sequencer。
差异表达基因同源性分析
与公共数据库（GeneBank nonredundant database）作DNA序列同源性比较，对于所测定的序列与公共数据库（GeneBank nonredundant database）用Blastn软件进行DNA序列同源性比较。通过Internet进入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast?Jfrom=1，按照说明填写Submit sheet，选择合适参数，实现在线DNA序列的同源性比较。
统计学分析
数据以X±SD表示，采用t检验分析。
结 果
AGM及FL基质细胞的形态及表型
体外培养中第6代AGM及FL基质细胞生长良好，以梭形成纤维细胞为主（图1）。流式细胞仪细胞表型检测结果显示，两株基质细胞系均高表达CD44、CD29，中等强度表达CD105，不表达CD34、CD45、CD14（表1），符合基质细胞的特征。
AGM来源基质细胞抑制消减杂交文库的建立
两次消减杂交及PCR的产物经过A-T克隆连接到PUC57/T载体后，经过Amp抗性和LacZ基因特异性的蓝白斑筛选，共挑选出276个菌落，用第2次PCR的引物扩增，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定，发现有特异性扩增条带（图2），切所扩增片段分子量在400-700 bp的克隆共有211个，阳性率高达76.4%。
基因芯片技术的检测
扫描图象图2、图3分别显示了1次Cy3及Cy5标记的探针与芯片杂交的结果，分别显示了抑制消减杂交文库中各个克隆在FL及AGM基质细胞中相对表达强度，经过机处理用不同颜色代表不同的表达强度，其中白色点为超高表达，表示信号表达达到饱和状态，其他点由红-蓝-黑色代表信号由强到弱。将4张芯片的结果综合分析后，经过筛选挑选出ratio值(差异表达倍数)大于3的克隆共有46个即差异表达克隆，其中ratio值大于5的明显差异表达的克隆共有18个。Table 1. Results of cellular phenotype detected by flow cytometry （略）
差异表达基因克隆序列的测定及同源性分析
利用Blastn软件将所获得的EST序列与公共数据库GeneBank nonredundant database 作DNA序列同源性分析。在所测序的18个克隆中，发现其中4个序列是未知序列，其中14个序列为已知序列，同源性分析结果如表2所示。Table 2. Results of homology analysis of 14 known clones（略）
讨 论
在胚胎造血发育过程中造血微环境存在明显的变迁，先后经历了由卵黄囊（YS）、主动脉-性腺-中肾区（AGM）、胎肝（FL）到骨髓（FBM）迁移过程。至今，造成这种造血个体发育中造血微环境迁移的机制仍不清楚。基质细胞是造血微环境中最重要的构成成分，毫无疑问，若能探明造血个体发育中不同基质细胞的基因表达的模式，找出在个体发育不同阶段（时空）中差异表达的起决定作用的基因，将对全面揭示造血个体发育的机制具有重要意义。
胚胎期造血分为原始造血(primitive hematopoiesis)和永久造血（definitive hematopoiesis）。在原始造血过程中，位于胚外的卵黄囊产生有核红细胞，提供胚胎生长发育所需的营养物质。随着胚胎的发育，原始造血被永久的多系造血所取代，永久造血的多能造血干细胞（HSC）具有自我更新和多向分化的能力。长期以来认为永久造血也是起源于胚外卵黄囊，然而近年来研究表明位于胚内的AGM区是永久HSC的起源部位［3］。在孕27-38天的人胚胎中约有800个HSC聚集在上肢芽水平的背主动脉中［5］，由于AGM区是永久HSC的最早产生部位，推测AGM区存在有利于HSC发育的造血微环境［6］。Xu等［3］从孕10.5天小鼠胚胎中分离出AGM区组织，建立AGM区基质细胞系，发现以AGM区基质细胞（AGM-S3）作饲养层，在不加造血生长因子的情况下亦可扩增人脐血的CD34＋细胞达5.3倍，而成年鼠骨髓基质细胞体系仅扩增2.3倍。而且AGM-S3不仅扩增CD34＋CD38＋细胞，还可扩增CD34＋CD38-细胞，对人长期重建HSC亦有支持作用。本课题组建立的hAGMS3同样具有支持长期造血作用（另文发表）。但至今，AGM区基质细胞通过何种机制吸引HSC及其前体细胞在此处定置、扩增并最终发育成功能完善的造血细胞的分子机制仍不清楚。
为探讨AGM区参与调控胚胎造血分化、发育的分子机理，我们采用抑制消减杂交结合高通量信息分析技术——基因芯片技术，克隆和筛选AGM区基质细胞较胎肝基质细胞中差异表达的基因［7］。结果发现，尽管AGM区基质细胞在细胞生长特性、形态等方面与胎肝基质细胞无明显差异，但是其基因表达谱较野生型胎肝基质细胞存在明显的差别。本次实验中筛选出在AGM基质细胞中差异表达上调的基因就有46个，其中明显差异表达上调（差异倍数达到5倍以上）的有18个。进一步对这18个克隆进行序列测定和基因同源性分析，我们发现，其中4条是全新的序列（另文报道），而其余的均为已知基因，这些已知基因主要为以下几类基因 ①细胞凋亡相关基因：如AFO27302、AF229832；②与细胞能量代谢及生物氧化相关酶类：如X76648、M22877； ③细胞信号转导相关基因；如AF037989、AF043045；④细胞迁移与运动有关的基因，如NM002531; ⑤血管生成相关基因，如NM018060、NM000459及;⑥与细胞分化发育有关的基因，如NM014564、X68879。
随着近年对造血细胞分化、发育调控机制的深入研究，一些与细胞分化、发育、增殖的基因逐渐引起人们的重视。本研究所发现，在AGM基质细胞中特异表达上调的众多基因中有两类基因引起我们注意，其一是与分化发育调控的基因如同源盒基因Lhx3及Emx2，既往研究表明Lhx3及 Emx2在调控神经系统等重要组织、器官的发育中中扮演重要角色［8，9］，但至今尚未见其参与胚胎造血分化、发育调控的报道，其在AGM调控造血细胞发生与发育中的作用更是不得而知，值得我们进一步证实与探讨；另一类基因是与血管及其内皮细胞发育有关的基因如TEK及HEY2［10，11］，血管内皮细胞作为造血微环境中最重要的组成部分，近年血管发生与造血器官分化与发育之间的关系日益引人关注，无疑这些与血管发生有关的基因的筛出将为我们阐明AGM区血管发生与造血器官分化与发育之间的关系提供重要的线索，值得进一步研究。
【】
1 Nobuhisa I，Kato R，Inoue H，et al. Spred-2 suppresses aorta-gonad-mesonephros hematopoiesis by inhibiting MAP kinase activation. J Exp Med，2004; 199: 737-742
2 Xu MJ，Tsuji K，Ueda T，et al.. Stimulation of mouse and human primitive hematopoiesis by murine embryonic aorta-gonad-mesonephros-derived stromal cell lines. Blood，1998; 92: 2032-2040
3 Tavian M，Robin C，Coulombel L，et al. The human embryo，but not its yolk sac，generates lympho-myeloid stem cells: mapping multipotent hematopoietic cell fate in intraembryonic mesoderm. Immunity，2001; 15: 487-495
4 陈惠芹，张绪超，黄绍良等. 人AGM区基质细胞系的建立及其生物学特性. 中山大学学报·医学版，2005； 26：20－23
5 Tavian M，Coulombel L，Luton D，et al. Aorta-associated CD34+ hematopoietic cells in the early human embryo. Blood，1996; 87: 67-72
6 Robin C，Dzierzak E. Hematopoietic stem cell enrichment from the AGM region of the mouse embryo. Methods Mol Med，2005，105:257-272
7 Bangur CS，Switzer A，Fan L，et al. Identification of genes over-expressed in small cell lung carcinoma using suppression subtractive hybridization and cDNA microarray expression analysis. Oncogene 2002; 21: 3814-3825
8 Galli R，Fiocco R，De-Filippis L，et al. Emx2 regulates the proliferation of stem cells of the adult mammalian central nervous system，Development，2002; 129: 1633-1644
9 Sobrier ML，Attie-Bitach T，Netchine I，et al. Pathophysiology of syndromic combined pituitary hormone deficiency due to a LHX3 defect in light of LHX3 and LHX4 expression during early human development. Gene Expr Patterns，2004; 5:279-284
10 Ward NL，Van-Slyke P，Sturk C，et al. Angiopoietin 1 expression levels in the myocardium direct coronary vessel development. Dev Dyn，2004; 229: 500-509
11 Fischer A，Schumacher N，Maier M. The Notch target genes Hey1 and Hey2 are required for embryonic vascular development. Genes Dev，2004; 18: 901-911.
