冻干血小板再水化后聚集
作者：刘景汉，卢发强*，庄远，车辑，陈麟凤
【摘要】 本研究旨在观察冻干血小板再水化后聚集反应性变化。以4种不同浓度的凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原作诱导剂，使用APACT2型血小板聚集仪，检测冻干再水化和新鲜血小板的最大聚集率，以ADP为诱导剂，检测胞内外海藻糖对再水化冻干血小板最大聚集率的影响。结果表明：当凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1 U/ml、1.6 mg/ml、20 μmol/L、2 μg/ml时，新鲜血小板最大聚集率达100%左右，冻干再水化血小板最大聚集率分别达（70.17±7.36）%、（15.3±2.81）%、（68.67±6.86）%、（64.67±11.6）%。胞内外海藻糖组、胞外海藻糖组、空白对照组冻干再水化血小板最大聚集率分别达(66.0±4.69)%、(25.3±2.42)%、(11.5±1.87)%(P＜0.01)。结论：凝血酶、瑞斯托霉素、ADP、胶原浓度分别为1 U/ml、1.6 mg/ml、20 μmol/L、2 μg/ml可作为血小板聚集实验的合适浓度，胞内外海藻糖使冻干再水化血小板最大聚集率显著提高。
【关键词】 再水化;冻干血小板；海藻糖；血小板
Aggregation after Rehydration of Lyophilized Platelets
Abstract This study was aimed to investigate the aggregation of rehydrated-lyophilized platelets. The aggregation rate of fresh and rehydrated-lyophilized platelets were measured by using thrombin，ristocetin，ADP and collagen as inductors and APACT2 aggregameter; the effects of intra- and extra-cellular trehalose on maximum aggregation rate of rehydrated-lyophilized platelets were detected by using ADP as an inductor. The results showed that the aggregation rate of fresh platelets was all about 100%，while aggregation rate of rehydrated lyophilized platelets was （70.17±7.36）%，（15.3±2.81）%，（68.67±6.86）%，（64.67±11.6）% respectively，when the concentration of thrombin，ristocetin，ADP and collagen was 1 U/ml，1.6 mg/ml，20 μmol/L and 2 μg/ml. The maximum aggregation rates of rehydrated-lyophilized platelets in intro-and extra-cellalar trehalose，extracellular trehalose and blank control groups were (66.0±4.69)%、(25.3±2.42)% and (11.5±1.87)% (P＜0.01)，meanwhile there was significant difference of rehydrated-lyophilized platelet aggregation rate between intra-and extra-cellular trehalose and extracellular trehalose groups (P<0.01). It is concluded that the concentrations of thrombin (1 U/ml)，ristocetin(1.6 mg/ml)，ADP (20 μmol/L) and collagen (2 μg/ml) are optimal for platelets aggregation tests，the internal and extracellular trehalose significantly enhance the aggregation of rehydrated-lyophilized platelets.
Key words rehydration ;lyophilized platelet; trehalose; platelet
血小板在37℃条件下，通过液相内吞途径，在4小时内可将海藻糖有效负载入血小板胞内［1-3］，负载海藻糖后的血小板便可进入下一步的冻干、再水化过程［4，5］。本研究对血小板冻干、再水化后聚集反应特性做了初步研究，现将研究结果报告如下。
材料和方法
主要试剂
海藻糖（trehalose，C10H22O11.2H2O，广西南宁中诺生物科技有限公司产品），PBS缓冲液（100 mmol/L NaCl、 9.4 mmol/L Na2HPO4、 0.6 mmol/L KH2PO4、 pH 6.8），蒸馏水，4种血小板聚集反应诱导剂分别为凝血酶、胶原、ADP、瑞斯托霉素。
主要仪器
ALPHA1-2 冻干机（德国产品），W21-Cr恒温水浴箱 (北京长安科仪产品)，HI9321 微电脑型 pH 计(HANNA公司产品），分析天平。兰波APACT2型血小板聚集仪（美生实业有限公司产品）。
血小板来源及制备
血小板来源于自愿无偿献血者，他们体检合格，1周内未服用阿司匹林等抗血小板药物。在室温条件下，用ACD三联采血袋采集全血后，离心制备的新鲜富含血小板血浆（FPRP），或用COBE Spectra血细胞分离机单采的浓缩血小板（Pc）。
再水化冻干血小板聚集反应
以4种不同浓度的凝血酶、胶原、ADP、瑞斯托霉素作为诱导剂，使用APACT2型血小板聚集仪，分别测定冻干前新鲜血小板、冻干再水化血小板的聚集反应。调整血小板计数为250×109/L，取调整好的PRP 250 μl，加入25 μl诱导剂，记录最大聚集率，遴选做血小板聚集实验的最适诱导剂浓度。
海藻糖对冻干再水化血小板聚集反应的影响
实验分3组。空白对照组：冻干前未负载海藻糖，冻干液未添加30 mmol/L海藻糖组和1%人血清白蛋白；胞外海藻糖组：冻干前未负载海藻糖，在冻干液中添加30 mmol/L海藻糖和1%人血清白蛋白；胞内外海藻糖组：冻干前负载海藻糖，冻干液添加30 mmol/L海藻糖和1%人血清白蛋白。
统计学处理
血小板冻干再水化后参数用(X±SD)表示，两均数间比较采用配对t检验，用CHISS统计软件录入数据，进行统计学处理。
结 果
凝血酶浓度对新鲜和再水化冻干血小板最大聚集率的影响
结果分别见表1和图1。在凝血酶生理浓度范围内，总体趋势是：随凝血酶浓度增加，血小板最大聚集率升高，当凝血酶浓度为1.0 U/ml时，新鲜血小板最大聚集率达101±3.347%，复水血小板最大聚集率为70.17±7.36%。Table 1. Effect of thrombin concentration on aggregation of fresh and rehydrated-lyophilized platelets(略)
瑞斯托霉素浓度对新鲜和再水化冻干血小板最大聚集率的影响
随着瑞斯托霉素浓度增加，血小板最大聚集率升高，当瑞斯托霉素浓度为1.6 mg/ml时，新鲜血小板最大聚集率达99.8±1.17%，复水后的血小板最大聚集率为15.3±2.81%（表2和图2）。Table 2. Effect of ristocetin concentration on aggregation of fresh and rehydrated-lyophilized platelets(略)
ADP浓度对再水化冻干血小板最大聚集率的影响
随着ADP浓度增加，血小板最大聚集率升高，当ADP浓度为20 μmol/L时，新鲜血小板最大聚集率达100.5±1.79%，再水化血小板最大聚集率为68.67±6.86%（表3和图3）。Table 3. Effect of ADP concentration on aggregation of fresh and rehydrated-lyophilized platelets(略)
胶原浓度对复水冻干血小板最大聚集率的影响
随着胶原浓度的增加，血小板最大聚集率（%）升高，当胶原浓度为2.0 μg/ml时，新鲜血小板最大聚集率达100.67±2.94%，再水化冻干血小板最大聚集率为64.67±11.6%(表4和图4)。Table 4. Effect of collagen concentration on aggregation of fresh and rehydrated-lyophilized platelets(略)
ADP对不同处理组再水化冻干血小板聚集反应的影响
胞内外海藻糖组的冻干再水化血小板经20 μmol/L ADP作用后的最大聚集率明显大于胞外海藻糖组（P<0.01），胞外海藻糖组的冻干再水化血小板的最大聚集率明显大于空白对照组，P<0.01（表5和图5）。Table 5. Maximum aggregatian rate of rehydrated-lyophilisated platelets in different treated groups（略）
讨论
前期血小板负载海藻糖研究结果表明，海藻糖可通过一种简单方法-液相内吞机理，在37℃条件下，经过4小时负载，被有效载入到血小板胞质内部，且在细胞质中均匀分布［6-8］，这为血小板冻干再水化后聚集功能的实验研究提供了理论依据。
从4种诱导剂作用下再水化冻干血小板聚集反应的剂量效应关系可看出，在正常生理范围内随着诱导剂浓度增加，再水化冻干血小板最大聚集率提高，但当诱导剂达到一定浓度时，血小板最大聚集率可维持在一恒定水平。本研究筛选的4种诱导剂的合适浓度分别为：凝血酶1 U/ml，瑞斯托霉素1.6 mg/ml，ADP 20 μmol/L，胶原2 μg/ml。这些适宜浓度可作为再水化冻干血小板聚集实验的基本条件。
有效负载海藻糖至细胞内是保证再水化冻干血小板功能恢复的关键，细胞外的海藻糖只能起到稳定细胞膜，而非细胞内物质的作用，只有胞内外海藻糖同时存在，且达到一定浓度，才能在细胞整个冻干再水化过程中，同时起到保护细胞内脂类和蛋白等物质和细胞膜的作用。血小板聚集实验是反应血小板功能的主要实验之一，血小板在诱导剂作用下，易发生激活、颗粒释放、及聚集反应变化。冻干保护剂-海藻糖在整个血小板冻干前的预处理、冻干、及冻干后再水化过程中，可有效抑制血小板的体外激活损伤，保护血小板聚集功能。海藻糖不仅可作为血小板的冻干保护剂，亦可作为其它组织、器官、造血干细胞的冰冻、冻干保护剂，它的巨大保护作用机理之一是生物大分子物质中的水分子替代学说，因而避免冻干损伤。由于它的较高玻璃化转化温度，因此在室温条件下形成稳定的玻璃化状态，保护干燥态的细胞。本研究表明，在ADP作用下胞内外负载海藻糖后血小板的最大聚集率明显大于胞外海藻糖组和空白对照组，这进一步证实了冻干保护剂-海藻糖的保护作用和血小板冻干前有效负载海藻糖的重要性［13］。
【】
1 刘景汉，周俊，欧阳锡林等. 人血小板冻干前海藻糖负载技术的优化. 实验血液学杂志，2005; 13: 698-702
2 卢发强，刘景汉，欧阳锡林等.人血小板冻干前负载海藻糖技术的研究.中国实验血液学杂志，2006; 14: 156-161
3 周俊，刘景汉，欧阳锡林等.血小板胞内海藻糖测定方法的建立和评价.中国实验血液学杂志，2004; 12: 837-840
4 Wolkers WF，Walker NJ，Tablin F，et al. Human platelets loaded with trehalose survive freeze-drying. Cryobiology，2001; 42: 79-87
5 Wolkers WF，Walker NJ，Tamari YE，et al. Towards a clinical application of freeze-dried human platelets. Cell Preser Technol，2003; 1: 175-188
6 周俊，刘景汉. 血小板冻干保存的研究进展. 中国实验血液学杂志，2004; 12: 542-545
7 卢发强，刘景汉，欧阳锡林等.冻干前负载海藻糖对血小板体外激活和聚集反应的影响.中国医师杂志，2005; 7: 1441-1443
8 卢发强.海藻糖及可逆性激活抑制剂在血小板冻干保存中的应用研究进展.中国医师杂志，2005; 7: 284-285
9 Oliver AE，Jamil KM，Crowe JH，et al. Loading human mesenchymal stem cells with trehalose by fluid-phase endocytosis. Cell Preser Technol，2004; 2: 35-49
10 Tunnacliffe A，Garcia-de-Castro A，Manzanera M. Anhydrobiotic engineering of bacteria and mammalian cells: is intracellular trehalose sufficient? Cryobiology，2001; 43: 124-132
11 Crowe JH，Tablin F，Wolkers WF，et al. Stabilization of membranes in human platelets freeze-dried with trehalose. Chem Phys Lipids，2003; 122: 41-52
12 Crowe JH，Crowe LM，Oliver AE，et al. The trehalose myth revisited: introduction to a symposium on stabilization of cells in the dry state. Cryobiology，2001; 43:89-105
13 Wolkers WF，Looper SA，Mckieman AE，et al. Membrane and protein properties of freeze-dried mouse platelets. Mol Membr Biol，2002; 19: 201-210.
