大鼠胎血与骨髓非造血成体干细胞体外分化能力的比较
作者：鞠秀丽，黄志伟，侯怀水，时庆，段春红，沈柏均
【摘要】 为了比较大鼠胎血和骨髓中非造血成体干细胞（non-hematopoietic adult stem cells，NASC）体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同，在无菌条件下采集孕大鼠的胎血和成年大鼠的骨髓，用Ficoll-hypague分离液分离出单个核细胞（MNC）后，种植于含10%胎牛血清的DMEM/LG培养液内。收获的NASC传代培养，用流式细胞仪检测细胞的免疫表型。β-巯基乙醇（β-ME）、二甲亚砜（DMSO）和叔丁基对羟基茴香醚（BHA）诱导NASC向神经元分化，用免疫细胞化学染色检测其特异性标志巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果发现: 传代培养后的两种NASC的形态相似，皆呈均一的梭形；流式细胞仪检测结果示两种NASC的免疫表型无明显差异，表达CD44、 CD54，不表达CD11b、CD45；定向诱导的两种NASC具典型神经元形态，免疫细胞化学染色显示nestin和NSE为阳性，但GFAP为阴性。结论：大鼠胎血和骨髓非造血成体干细胞的细胞形态、生物学特性无明显差别；两者都可被诱导分化为神经元样细胞；胎血应是NASC的又一来源。
【关键词】 成体干细胞；非造血成体干细胞；胎血；骨髓；细胞生物学；神经元样细胞
Differentiating Ability of Non-hematopoietic Adult Stem Cells from Rat Fetal Blood and Bone Marrow In Vitro
Abstract To compare the growth characteristics of non-hematopoietic adult stem cells (NASC) derived from rat fetal blood and rat bone marrow in vitro， and to study the differentiation of these stem cells into neuron-like cells in vitro，the fetal blood of pregnant rats and bone marrow of adult rats were sterilely collected; mononuclear cells (MNC) were isolated by using standard Ficoll-hypague techniques and then cultured in DMEM/LG containing 10% fetal bovine serum (FBS). The acquired NASCs were subcultured for passage. The immunophenotype of NASCs was detected by flow cytometry. The expanded NASCs were induced to differentiate into neurons-like cells by β-mercaptoethanol (β-ME)， dimethylsulfoxide (DMSO)，butylated hydroxyanisole (BHA). The specific markers of these neuron-like cells were detected by immunocytochemistry. The results showed that two kinds of subcultured NASCs showed homogeneous spindle-shaped and expressed antigens CD44 and CD54，but did not expressed CD11b and CD45. The both induced cells were similar to neuron in morphology and were positive for nestin and neuron-specific enolase (NSE)，but negative for glial fibrillary acidic protein (GFAP). It is concluded that no significant difference of NASCs derived from pregenant rate fetal blood and adult rat bone marrow found in cell morphology and biological characteristics. NASCs of both origins can be induced to differentiate into neuron-like cells，so fetal blood can be regarded as another resource of NASC.
Key words adult stem cell；non-hematopoietic stem cell； fetal blood; bone marrow; cell biology; neuron like cell
非造血成体干细胞（non-hematopoietic stem cell，NASC）是骨髓中除造血干细胞外的来自各胚层的成体干细胞，包括具有CD34-及贴壁生长特点的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、心肌干细胞、神经干细胞等。在适宜的信号刺激下NASC能够被诱导分化成不同的骨髓微环境组成成分，如成骨细胞、 脂肪细胞和基质细胞，也能分化为神经细胞［1］、 肝细胞等。最近有学者已证实了人脐血也能分离培养出NASC，后者可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞及肝细胞等分化［2］。相对于骨髓NASC来讲，脐血的来源丰富，收集方法简便易行，微生物和肿瘤细胞污染的可能性比较小，避免了自体髂骨穿刺获取骨髓的局限性。因此，脐血NASC作为一种新来源，用于细胞工程研究具有广阔的前景。我们分离培养大鼠胎血和骨髓NASC，观察比较两者生长特性及向神经元样细胞的分化能力有何异同。
材料和方法
动物与试剂
20只孕20天的Wistar大鼠、15只健康成年Wistar大鼠（雌雄不限）均购于山东大学实验动物中心，DMED/LG培养液、胎牛血清（FBS）购于Gibco公司，β-甘油磷酸、异丙基甲基黄嘌呤、β-巯基乙醇（β-ME）、二甲亚砜（DMSO）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）购于Sigma公司，FITC标记的小鼠抗大鼠CD11b、CD44、 CD54、 CD45单克隆抗体及小鼠IgG1单克隆抗体购于SEROTEC公司，兔抗大鼠GFAP、nestin、NSE抗体及免疫组织化学试剂盒购于Boster公司。
胎血NASC分离培养
无菌条件下，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg使孕鼠麻醉后，剖腹取胎鼠，剪断其颈部吸取断面血液，剪开胸腔抽取其心脏中血液至含肝素30 U/ml的DMEM/LG 培养液中。密度梯度离心法收获MNC，PBS洗涤2次，按1×108 cells/cm2的细胞密度接种于培养瓶中，培养液为含10% FBS、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml的DMEM/LG，将培养瓶置于37℃、饱和湿度的5% CO2培养箱中培养。1周后首次换液，每周换液2次。当细胞融合达70%-80%时用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶3传代培养。
骨髓NASC分离
过量麻醉处死大鼠，无菌条件下取出股骨、胫骨，用含肝素30 U/ml的DMEM/LG 培养液反复冲洗骨髓腔，获得骨髓冲洗液后离心、种植培养方法同上述胎血。
NASC的免疫表型检测
分别取扩增3、6代的胎血和骨髓NASC，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后，再用含10% FBS的PBS洗涤，制成浓度为1×106 cells/ml的单细胞悬液。分别加入 10 μl FITC 标记的小鼠抗大鼠CD11b、CD44、CD54、CD45单抗，阴性对照加入小鼠IgG1-FITC，避光室温孵育30分钟，PBS洗涤，流式细胞仪检测。
NASC诱导分化成成骨细胞
选第5代胎血和骨髓NASC，培养体系为含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸和0.2 mmol/L抗坏血酸（美国Sigma公司）的DMEM。每周换液2次。在2周左右两者均可以形成成骨细胞，用茜素红染色，可见细胞浆中有大量的钙沉积。碱性磷酸酶染色呈阳性。
NASC诱导分化成脂肪细胞
选第五代胎血和骨髓NASC，诱导分化剂由1 μmol/L氢化考的松、0.5 mmol/L异丙基甲基黄嘌呤、0.1 mmol/L消炎痛和10％兔血清组成，培养液仍为DMEM，3-4天换液1次，在20天左右两者均可以形成脂肪细胞，进行油红染色，可见细胞浆内充满了油滴空泡。
诱导NASC向神经元样细胞分化及鉴定
定向诱导
分别取第5代胎血和骨髓NASC，以5×103 cells/cm2浓度接种于铺有载玻片的6孔板中制备细胞爬片。将细胞爬片随机分为实验组和对照组。实验组采取两步诱导法：先用含10% FBS、5 mmol/L β-ME的 DMEM/LG诱导1天后换为含10% FBS，2% DMSO，2 μmol/L BHA的DMEM/LG诱导1天。对照组仅用含10% FBS的DMEM/LG培养，不添加任何诱导剂。倒置相差显微镜下观察细胞形态的变化。
免疫细胞化学鉴定
细胞爬片经PBS洗涤后用冷丙酮固定，在H2O2与甲醇1∶50混合溶液中室温封闭去除内源性过氧化物酶，滴加山羊血清封闭液孵育，再滴加兔抗大鼠nestin、NSE、GFAP抗体，4℃过夜，生物素化山羊抗兔IgG 37℃孵育20分钟，再与链酶亲和素-过氧化物酶（SABC）反应20分钟，DAB显色，苏木素复染。阴性对照用PBS代替抗体，实验对照用未诱导的细胞爬片进行染色。
结果
NASC的生长特性
镜下观察，胎血贴壁细胞生长较快，原代培养7天时大部分呈纤维样束状排列，有少量圆形细胞成团或单个散在（图1）。大约10天时细胞达70%-80%融合首次传代。从第3代之后，视野中为形态均一的梭形细胞。这些细胞增殖一代约需4-8天，8代以内保持较快增长速度。骨髓细胞成分复杂，原代培养7天时贴壁细胞形态不均一，呈三角形、锥形或蝌蚪状，也有部分圆形细胞存在。约2周细胞首次传代，第3代以后呈均一的成纤维状，增殖速度与胎血MASC相似。
NASC免疫表型
流式细胞仪检测显示第3、6代NASC均表达CD44、 CD54，不表达CD11b、CD45。
NASC向神经元样细胞分化的形态变化及鉴定
β-ME诱导胎血NASC 7小时后原来的部分长梭形细胞开始缩短，胞体呈类圆形，且周围有多个不规则突起。换为DMSO、BHA后，胞体进一步收缩，约50%-60%细胞变为双极、多极和锥形，出现类似神经元的形态，有些细胞突起细长类似神经元的树突。β-ME诱导骨髓NASC 12小时后细胞形态明显改变，胞体收缩变圆，立体感增强，有突起长出，随后突起逐渐增多；换为DMSO、BHA后，细胞间突起相互连接，其胞体收缩成锥形、三角形或不规则形，折光性强，细胞伸出较多的细长突起，有的还有1-2级分支。对照组细胞形态无变化（图2）。
免疫细胞化学鉴定结果显示：β-ME诱导24小时以内，胎血和骨髓NASC均已开始表达Nestin，而NSE、GFAP不表达。DMSO、BHA诱导1天后，NSE也呈阳性表达，阳性细胞胞浆呈棕黄色，GFAP始终阴性。未诱导细胞均不表达Nestin、NSE、GFAP。分别两种NASC分化后Nestin、NSE阳性率（显微镜下记数300个细胞中Nestin、NSE阳性细胞数而所得的百分比），经统计学分析差异无显著性。
讨论
随着NASC研究的深入，已有不少来源于成人骨髓外NASC的报道，如脐血、外周血、胎儿骨髓、脂肪和肌肉的NASC等。Goodwin等［3］报道，从脐血分离的CD34-及贴壁生长的细胞具多系分化能力，可分别表达成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞的标志。
本研究结果表明，妊娠大鼠的胎血与成年大鼠的骨髓NASC生长特性相似，随着传代次数增加细胞逐渐纯化，呈形态一致的梭形，且增殖能力相同。只是在原代培养的初期，两种贴壁细胞形态和成分略有不同，骨髓细胞更为复杂。两种NASC的表面抗原表型一致，CD54、CD44阳性，但不表达各细胞系标记如CD34、CD11b和CD45。CD54是细胞间黏附分子，CD44是归巢相关黏附因子，CD11b为NK细胞、粒细胞、单核/巨噬细胞、T细胞、B细胞的表面抗原，CD45为所有白细胞共同抗原。这说明胎血NASC与骨髓的一样，是源于非造血细胞的一类抗原稳定未分化的干细胞。
研究还发现，在相同的诱导条件下，妊娠大鼠的胎血与成年大鼠的骨髓NASC向神经元分化过程中形态变化不完全一致，但共同特点是细胞胞体缩短变圆有细长的多个突起，具有典型神经元的形态。我们认为，形态学不一致可能与诱导前细胞自身状态及来源不同有关，以至分化后形态变化不尽相同，这不足以说明两者分化能力和特性不同。应该以分化细胞是否表达神经元标志物来判断。免疫细胞化学染色显示：β-ME诱导24小时以内，胎血和骨髓NASC均已开始表达nestin，而DMSO、BHA诱导1天后，NSE也呈阳性，GFAP始终为阴性。统计学分析妊娠大鼠胎血与成年大鼠骨髓NASC分化后nestin、NSE阳性率无显著性差异，说明两者向神经元样细胞分化的能力相同。nestin是一种神经元中间丝蛋白，为神经干细胞特异标志物，其表达始于神经胚形成时，当神经细胞迁移基本完成后，其表达逐渐减少，并随神经细胞分化的完成而停止。当神经元发育成熟时表达NSE，它是γ-γ糖酵解酶的同工酶，存在于神经元胞浆中。GFAP属细胞骨骼蛋白，是星形胶质细胞标志物。上述研究提示，NASC经诱导后首先分化为神经干细胞，然后向成熟的神经元分化，但不分化为星形胶质细胞。诱导剂β-ME、BHA有强抗氧化作用，已知在β-ME的作用下，细胞形态由梭形收缩成圆形、近圆形，这可能与其改变细胞氧化状态有关；β-ME能保护神经细胞的存活，促进轴突的显著增长，促进谷胱甘肽合成，清除氧自由基，但其具体作用机制尚待进一步研究。
NASC对不同的诱导因子反应不同，即使同种诱导剂，浓度及作用时间的差异也会引起NASC的反应各异，这导致了有些研究结果不甚一致。经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、DMSO、BHA诱导后，大部分NASC分化为神经元，而在bFGF、脑源神经营养因子(BDNF)的作用下，部分分化为神经胶质样细胞［4］。以全反式维甲酸、β-ME、cAMP 、bFGF、BDNF等作为诱导剂，经诱导的NASC中有69%细胞形态学上呈现神经胶质细胞的形态，有轴突样结构突起，且随诱导时间胶质细胞标志物的表达逐渐增多［2］。应用BDNF、NFκB受体活化子配体(RANKL)能诱导NASC同时向神经元和星形胶质细胞分化，且两者联合应用比单独应用时细胞分化率高［5］。因此，探讨诱导剂的最佳浓度、最佳组合及提高NASC分化率仍是需要研究者共同努力解决的重要问题。
本实验不仅说明了妊娠大鼠胎血与成年大鼠骨髓NASC都具有自我增殖的特性，而且被诱导分化为神经元样细胞的能力相同。作为干细胞的来源，人类脐血来源广泛、容易获得、免疫源性低等优点是骨髓无法相比的，这为今后人脐血NASC移植神经系统疾病提供了动物实验依据。
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