Smad4在白血病细胞中表达的初步研究
作者：张琰，曹旭，江明，哈力代，温丙昭，李玲，
刘辉，钟笛，林仁勇，卢晓梅，冯晓辉，温浩
【摘要】 TGF-β信号的缺失与许多组织的恶性增生有关，Smad4是该通路的重要蛋白，其缺失或突变与多种癌症相关。本研究目的主要是探讨细胞浆信息传递介质Smad4在白血病细胞中的定位及表达。分离白血病病人骨髓单个核细胞，镜下鉴定白血病细胞数量达90%以上，应用免疫组织化学技术检测白血病细胞中Smad4蛋白的表达。结果表明： Smad4蛋白主要表达于细胞核中，部分表达于胞浆中，35例白血病病人中6例急性淋巴细胞性白血病患者Smad4无表达，包括L1 1例，L3 1例，L2 4例；7例急性非淋巴细胞性白血病（1例M0，1例M1，2例M2a，1例M3a，1例M4b，1例M6）和1例慢性粒细胞性白血病患者白血病细胞中也无Smad4表达，其余病人白血病细胞中均表达Smad4。结论： Smad4主要定位于细胞核中，在部分白血病细胞中无表达，Smad4基因或功能的改变可能与人类AML的发生有关。
【关键词】 生长转化因子β； Smad4蛋白； 急性白血病； 白血病细胞
xpression of Smad4 in Leukemia Cells
Abstract Loss of transforming growth factor (TGF)-β signaling has been implicated in malignant transformation of various tissues. Smad4 plays a central role in the signal transduction of TGF-β. Deletion or mutation of Smad4 has been described in a number of cancers. This study was aimed to investigate a potential role of Smad4 in leukemia including its expression and location in blast cells. The mononuclear cells were separated from bone marrow of leukemia patients. The samples，blast cells of which were more than 90% in mononuclear cells，were selected. The expression and location of Smad4 protein were analyzed by immunohistochemistry methods. The results showed that the Smad4 protein located mainly in nucleus，part of this protein located in cytoplasma，the expressions of Smad4 were not detected in 6 out of 9 ALL patients，in 7 out of 24 AML patients and in 1 out of 2 CML patients; these leukemia patients，in whose cells the expression of Smad4 was not detected，included one L1 and one L3，four L2，one M0，one M1，two M2a，one M3a，one M4b，one M6 and one CML. In conclusion，the Smad4 protein was mainly in nucleus，the deletion or functional change of Smad4 may related with the pathogenesis of human AML.
Key words transforming growth factor-β; Smad4 protein; acute leukemia; leukemic cell
Smad 蛋白家族是近年来发现的新的细胞内信号转导蛋白，它在TGF-β超家族成员的信号转导中具有重要的作用，其中Smad4在TGF-β超家族各个细胞因子的信号转导途径中都是必不可少的，它参与TGF-β超家族所有成员的细胞内信号转导过程［1］。Smad4最早被认为是一种肿瘤抑制因子，它的缺失或突变与许多癌症相关，包括胰腺癌、乳癌和大肠癌［2，3］。急性髓细胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）是髓系来源的白血病细胞的恶性增生而最终导致正常造血系统受到抑制的疾病［4］，其原因至今还不清楚［5-7］。TGF-β是造血细胞增殖的负向调控因子，它从多种途径抑制造血细胞的生成［8］。因此，TGF-β对造血系统的抑制作用一旦被打破，可能更有利于AML细胞的增生。由于Smad4的改变会影响TGF-β的信号转导，因此本研究检测不同白血病细胞中Smad4的表达情况，旨在探讨Smad4蛋白在白血病发病中的作用。
材料和方法
标本来源
35例白血病骨髓标本来自2002-2004年在新疆医科大学第一附属血液科住院的患者。患者经实验室骨髓形态学及免疫分型检测有准确的FAB 分型诊断结果（表1）。采用的标准为：骨髓白血病细胞均达70%以上，淋巴细胞分离液分离单个核细胞后白血病细胞占90%以上。骨髓标本按常规细胞冻存方法保存于液氮中。正常对照来自我院门诊体检健康者。
Table . Smad4 expression in patients with leukemias by immunohistochemical method（略）
试剂及仪器
Smad4小鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司，AEC显色剂及DAB显色试剂盒均为武汉博士德公司产品。A×70型显微镜系统为日本Olympus公司产品，显微图象分析采用Metamorph软件（美国UIC公司产品）。
Smad4在白血病细胞内的定位及表达的免疫组织化学检测
采集白血病病人骨髓血3-4 ml，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，显微镜下计数，选取单个核细胞分离后白血病细胞百分比大于90%的标本，细胞涂片，丙酮固定，梯度乙醇脱水，用蒸馏水冲洗2遍；放于3% H2O2中并在室温下浸泡10分钟，滴加Smad4抗体（抗体按1∶400稀释），37℃静置1小时，用PBS冲洗3遍，每次5分钟，滴加二抗，室温下反应30分钟，用PBS洗3遍，AEC或DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明，中性树脂封片。阳性染色为棕黄色，阴性染色为蓝色。
结果
Smad4蛋白主要表达于细胞核中。本实验的正常对照细胞中的Smad4主要表达于细胞核中，部分胞浆中也有少量表达（附图A，B）。白血病细胞中的Smad4也以胞核表达为主。共收集符合标准的9例急性淋巴细胞性白血病（ALL），其中有6例（67%）胞浆和胞核中未表达Smad4蛋白（附表和附图C，D），24例急性非淋巴细胞性白血病（AML）中有7例（29%）未表达Smad4蛋白，包括1例M0，1例M1，2例M2a，1例M3a，1例M4b，1例M6（附图F-I）； 2例慢性粒细胞性白血病中1例未表达Smad4（附图J）。
讨论
TGF-β调控细胞的增生、分化、凋亡等多种过程［9］，它在肿瘤的过程中起重要作用，TGF-β信号通路被认为是肿瘤的抑制性通路。Smad4相对分子量为60 kD左右，存在与人类染色体18q21，1，由11个外显子组成。它是TGF-β超家族成员信息传递必需的中心转导分子，对细胞增殖具有重要调控作用［10］。
我们的研究结果提示：在正常人的细胞中，Smad4主要表达于细胞核中，细胞浆中也有少量表达，大部分白血病细胞Smad4的表达与正常细胞相似。因此，Smad4在白血病细胞中主要定位于细胞核。同时，在9例ALL病例中，有6例无Smad4的表达，分别为1例L1，1例L3，4例L2；23例AML中7例急性非淋巴细胞性白血病（1例M0，1例M1，2例M2a，1例M3a，1例M4b，1例M6）和1例慢性粒细胞性白血病患者白血病细胞中均未见Smad4的表达，其原因可能是： ①丝氨酸依赖性的裂解活性导致Smad4的体外降解，但有关降解机制还不明确［11］；②Smad4序列中存在突变。Yoichi等［12］发现，AML病人中的两种Smad4突变，1种是由错义突变导致的MH1结构域单个氨基酸的改变，另一种是CTV-1细胞系（源于急性单核细胞性白血病的细胞系）中的MH2结构域羧基末端框移突变。这两种突变最终使Smad4失去了促进靶基因翻译的作用，而且它们可能抑制野生型Smad4结合DNA的能力，或者可能抑制野生型Smad4向核内转移的过程。因此，我们的研究提示Smad4基因或功能的改变可能与人类AML 的发生有关。Smad4 在造血系统的TGF-β信号传递过程中有重要作用，它的缺失将导致信号传递受阻。本研究结果从一定角度提示：阻断TGF-β信号通路可能导致急性白血病的发生。
在对Smad家族其他成员的研究中，Wolfraim等［13］研究认为，Smad3在T淋巴细胞性白血病中是一重要的抑癌基因，在有的病人体内其mRNA水平表达正常，但有的病人同样出现了Smad3蛋白的缺失。Smad3单独不会引发白血病，但若协同其他因素如P27Kip细胞依赖激酶抑制因子的改变，则会诱发白血病。
可见，Smad家族在白血病的发生中起重要作用。它们的改变直接影响了TGF-β信号通路。我们发现，Smad4在一些白血病中表达缺失，这为今后进一步研究Smad家族成员在白血病中的作用奠定了基础。
【】
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10 Zhang Y，Musci T，Derynck R. The tumor suppressor Smad4/DPC4 as a central mediator of Smad function. Curr Biol，1997; 7:270-276
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12 Imai Y，Kurokawa M，Izutsu K，et al. Mutations of the Smad4 gene in acute myelogeneous leukemia and their functional implications in leukemogenesis. Oncogene，2001； 20：88-96
13 Wolfraim LA，Fernandez TM，Mamura M，et al. Loss of Smad3 in acute T-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med，2004; 351:552-559.
