rhG-CSF对健康供者外周血和骨髓免疫特性影响的比较
作者：赵翔宇，常英军，黄晓军
【摘要】 本研究探讨rhG-CSF对健康供者外周血采集物（G-PB）和骨髓采集物（G-BM）免疫学特性影响的异同。用MTT法和夹心酶联免疫复合物（ELISA）法检测G-PB和G-BM中T淋巴细胞增殖能力和IL-4、IFN-γ的分泌，并用流式细胞术测定两种移植物的T细胞亚群、树突状细胞（DC）亚群、单核细胞及共刺激分子CD28的表达。结果表明： G-PB中淋巴细胞，CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞，DC1、DC2以及单核细胞的含量，CD4/CD8的比值高于G-BM（P＜0.001）。G-PB的T淋巴细胞增殖能力高于G-BM（P＜0.05）；每微升G-PB移植物中T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-4的量均明显高于G-BM，且G-PB中IL-4/IFN-γ比值小于G-BM（P＜0?001），DC2与T淋巴细胞的比值也低于G-BM（P＜0.01）；而G-PB中CD4+、CD8+细胞上CD28表达的百分比和总体表达均高于G-BM（P＜0?001）。结论： rhG-CSF体内应用诱导G-PB和G-BM产生的T细胞免疫低反应性是有差异的，而两者之间的差异是G-PB和G-BM移植后移植物抗宿主病（GVHD）发生率和程度不同的免疫学基础。
【关键词】 粒细胞集落刺激因子；外周血移植物；骨髓移植物；共刺激分子；免疫低反应性
Effects of rhG-CSF Mobilization on Immunological Properties of Grafts from Peripheral Blood and Bone Marrow
Abstract This study was aimed to investigate the difference of immunological properties between recombination human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF) mobilized peripheral blood grafts (G-PB) and rhG-CSF primed bone marrow grafts (G-BM).The lymphocyte proliferation ability and the quantities of interleukin-4 (IL-4) and interfe-ron-γ (IFN-γ) secreted by T cells were determined by using MTT assays and sandwich ELISA; T cell subgroups，dendritic cells (DC)，monocytes and the expression of CD28 costimulatory molecules on T cells were determined by multicolor flow cytometry. The results showed that the absolute numbers of lymphocytes，monocytes，CD3+，CD4+ and CD8+ T cells as well as DC1 and DC2，the ratios of CD4/CD8 in G-PB were significantly higher than those in G-BM，respectively (P＜0.001). T cell proliferation ability was significantly higher in G-PB than that in G-BM (P＜0.05). The quantities of IFN-γ and IL-4 secreted by T cells per micromilter of G-PB was significantly higher than those of G-BM，the ratios of IL-4/IFN-γ were significantly lower in G-PB than that in G-BM (P＜0.001). As compared with G-BM，the ratio between DC2 and T-lymphocyte was significantly low in G-PB (P＜0.01)，whereas the percentage and overall expression of CD28 on CD4+ and CD8+ cells were significantly high in G-PB (P＜0.05). It is concluded that T cell hyporesponsivenesses of G-PB and G-BM induced by rhG-CSF in vivo were confirmed to be different，and the difference of immunological properties between G-PB and G-BM may explain the lower incidence of GVHD and lower relapse after G-BM and G-PB transplantation respectively.
Key words granulocyte colony-stimulating factor; peripheral blood stem cell graft; bone marrow graft; immunohy-poresponsiveness; costimulatory molecules
我们的实验结果表明，与未动员的外周血相比，rhG-CSF体内应用诱导外周血采集物（G-PB）T细胞产生了免疫低反应性，促使Th1型细胞向Th2型细胞极化，并改变了外周血采集物中单核细胞和树突状细胞（DC）等的免疫组成［1，2］；随后我们又以静态的骨髓为对照，研究发现rhG-CSF体内应用同样也部分改变了骨髓采集物（G-BM）的免疫细胞组成，诱导骨髓移植物T细胞免疫低反应性、促使Th1型细胞向Th2型细胞极化［3］。上述研究为G-PB/G-BM混合移植提供了理论依据［1-5］。最近，随机临床研究证实，G-BM移植较G-PB移植具有移植物抗宿主病（GVHD）发生率低、免疫抑制剂应用期短等优势［6］。因此我们推测，rhG-CSF体内应用可能对健康供者外周血采集物和骨髓采集物免疫特性的影响存在差异，而这些差异的阐明将对干细胞来源的选择和个体化移植的开展具有重要意义。为此，我们研究了G-PB和G-BM在免疫学特性方面的异同。
材料和方法
材料
标本来自2003年4—10月在我院接受异基因造血干细胞移植的15名亲缘供者，男8名，女7名，中位年龄40岁（13岁-65岁）。皮下注射rhG-CSF 5 μg/(kg·d)，连续5天，在第4天按照我院常规采集骨髓输注给患者，同时留取肝素抗凝的骨髓采集物10 ml，第5天留取外周血采集物2 ml，各取0.5 ml-1 ml行活细胞免疫荧光标记；用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（MNC），常规记数，台盼蓝活细胞染色拒染率在98%以上，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（Gibco公司产品）调整细胞浓度为5×106/ml备用。
免疫荧光标记抗体均购自Becton Dickinson公司（表1）；植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA），四甲基偶氮唑盐（monotetrazolium，MTT），盐酸十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）均为Sigma公司产品；夹心ELISA试剂盒购自深圳晶美生物技术公司。Table 1. Combinations of fluorochrome-labeled monoclonal antibodies (McAb) used for flow cytometry determination（略）
流式细胞术检测
采用三色或四色荧光标记技术，抗体组合见表1，活细胞膜抗原直接标记法参见［1］。每管取G-BM 100 μl或G-PB 30 μl，分别加入表1中所示各种抗体，4℃避光孵育15分钟；加溶血素2 ml室温避光10分钟，溶解红细胞，；然后200×g离心5分钟，弃上清，用PBS将标记细胞洗涤2次；加入含1%多聚甲醛PBS 200 μl，固定后24小时内上流式细胞仪检测。
流式细胞仪测定结果分析
用Cellquest软件（Becton Dickinson公司的FACSsort型流式细胞仪）分析。T淋巴细胞亚群和DC亚群分析以及CD28测定参见文献［3］。用FSC/SSC设门画出淋巴细胞群（R1），二维点图显示R1内细胞，设CD3阳性细胞群为R2，在R2内分别显示CD4/CD8、CD3/CD28、CD4/CD28、CD8/CD28二维点图，分析CD3+、CD4+、CD8+细胞的比例以及这些细胞上CD28表达的百分比和荧光强度，并CD8+CD28-抑制性T细胞占有核细胞的比例。
DC细胞为Lineage，包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD34、CD56均阴性，HLA-DR阳性的细胞。进一步根据CD11C的表达将DC分为CD11C+（即DC1）、CD11C-（即DC2），并计算DC、DC1以及DC2占有核细胞的百分比。
T细胞增殖能力测定
将PBMNC或BMMNC接种在96孔板中，每孔100 μl，含105细胞，设复孔3个，与终浓度为10 μg/ml的植物血凝素（PHA）共同孵育72小时，同时设对照孔（不加PHA），最后4小时加入10 μl 四甲基偶氮唑盐（MTT，5 mg/ml），用100 μl 0.1%盐酸十二烷基硫酸钠（SDS）终止过夜，570 nm酶标仪读取OD值［3］。
刺激指数（SI）=PHA刺激孔OD值/对照孔OD值
夹心ELISA测定细胞因子
标本制备：将PBMNC或BMMNC接种于24孔板中，每孔含T细胞1×106，设3个复孔，与终浓度为10 μg/ml的PHA共同孵育48小时，离心收集上清液，分装后置-30℃冰箱保存待测。IL-4和IFN-γ采用夹心ELISA方法测定，严格按照产品说明书操作［3］。每微升G-PB和G-BM中所含的MNC产生的Ⅰ型细胞因子（IFN-γ）以及Ⅱ型细胞因子（IL-4）的数量由计算所得，计算公式为：Ⅰ或Ⅱ型细胞因子的量 = 细胞因子的产量（pg/106 MNC）×细胞数（MNC/μl）
统计学处理
所有数据均采用均数±标准差（X±SD）表示，应用独立样本t检验，SPSS 10.0统计软件进行分析。
结果
G-PB和G-BM中T淋巴细胞功能的对比
G-PB的T细胞增殖能力（1.13±0.24）明显高于G-BM（0.98±0.24）（P＜0.05）；每微升G-PB所含T细胞产生的IFN-γ ［（13.19±14.33）pg vs（1.13±0.57）pg，P＜0.001］和IL-4的数量［（3.67±1.77）pg vs（0.75±0.24）pg，P＜0.001］ 分别高于G-BM 中T细胞分泌细胞因子的量; G-PB中IL-4/IFN-γ比值（0.32±0.23）小于G-BM（0.73±0.16）（P＜0.001）。
G-PB和G-BM中T细胞上CD28表达的对比
与G-BM相比，G-PB中CD3+、CD4+、CD8+细胞上CD28表达的百分比明显增高（P＜0.05）；CD4+、CD8+细胞上CD28的总体表达也高于动员的骨髓（P＜0.05)（表2-4）。Table 2. Expression of CD28 costimulatory molecules on T cells of G-PB and G-BM （略）Table 3. Expression of CD28 costimulatory molecules on T cells of G-PB and G-BM （略）Table 4. Expression of CD28 costimulatory molecules on T cells of G-PB and G-BM （略）
G-PB和G-BM中T淋巴细胞和单核细胞数量的比较
结果如表5所示，G-PB中淋巴细胞，CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞和单核细胞的数量均明显高于G-BM（P＜0.001）。G-PB中CD4/CD8的比值（1.59±0.53）也显著高于G-BM（0.91±0.29）（P＜0?001），而单核细胞和T淋巴细胞的比值（0.36±0.20）与G-BM（0.27±0.12）相比，差异无显著性。
G-PB和G-BM中DC亚群数量的比较
G-PB中DC1和DC2的含量较G-BM显著升高（P＜0.001）（表5）；G-PB中DC2与T淋巴细胞的比值［（0.91±0.77）%］显著地低于G-BM［（3.02±2?65）%］（P＜0.01）。
讨 论
rhG-CSF体内应用使外周血和骨髓T细胞产生了免疫低反应性，并促进Th1型细胞向Th2型细胞极化［1-3］；T细胞免疫低反应性以及Th1向Th2型细胞极化使GVHD的发生率下降［7］，而后者是HLA不合移植的主要障碍之一 ［4］。我们的研究从理论和实践两方面论证了G-PB和G-BM移植跨越HLA屏障的可行性［1-4］。Table 5. Immunological cell composition of G-PB and G-BM (略)
我们发现，rhG-CSF对G-PB和G-BM T细胞免疫特性的影响方面存在差异。从数量上讲，G-PB中T淋巴细胞各亚群的数量明显高于G-BM，G-PB中CD4+/CD8+细胞的比值显著高于G-BM；就增殖能力而言，G-PB中T淋巴细胞的增殖能力也显著高于G-BM。由于T淋巴细胞增殖能力是T淋巴细胞免疫低反应性的标志，并且rhG-CSF体内应用同时诱导外周血和骨髓T淋巴细胞产生了免疫低反应性［1-3］，因此G-BM中的T淋巴细胞较G-PB具有更低的免疫反应性；从细胞因子分泌的角度看，rhG-CSF显著降低了外周血和骨髓T细胞分泌IFN-γ的水平，外周血T细胞分泌IL-4的水平无变化，骨髓T淋巴细胞分泌IL-4的量却降低，不过两种移植物分泌细胞因子的改变均导致IL-4/IFN-γ比值增加［1-3］，IL-4/IFN-γ比值以G-BM为高。研究表明，Th2型细胞因子，尤其是IL-4可直接作用于Th0细胞，促使其向Th2型细胞分化，进而降低GVHD的发生率［8］。与G-PB相比，G-BM中Th2极化和T淋巴细胞低反应性可能是G-BM和G-PB移植后GVHD发生率和程度不同的免疫学基础。Jung等［9］发现Th1型细胞是移植物抗白血病（GVL）作用的主要效应细胞；Th2型细胞则更能耐受CD95（Fas）介导的细胞凋亡而长期存活，并参与慢性GVHD的发生［10］。因此，G-PB中Th1型以及Th2型细胞因子或细胞的高含量可能不仅有助于G-PB移植后GVL效应的发挥，从而降低复发率［11］；而且大量Th2型细胞的长期存活可能又增加了G-PB移植后慢性GVHD的发生率 ［8，11］。
rhG-CSF对参与T细胞活化的免疫细胞和免疫分子的影响也存在差异。首先，G-PB中DC2和T淋巴细胞的比值显著低于G-BM；其次，G-PB中CD4+、CD8+ T细胞上CD28的表达明显高于G-BM。虽然rhG-CSF动员后DC2数量的增加和CD28/B7共刺激信号的下调可能同时参与外周血和骨髓T细胞免疫低反应性的形成［1-3，12］，但是两种移植物在DC2和T淋巴细胞比值以及共刺激分子CD28表达方面的差异与两种移植物T淋巴细胞免疫功能方面差异的形成是否有关，尚待今后的研究证实。
总之，rhG-CSF通过相同或不同的机制诱导外周血和骨髓T细胞产生免疫低反应性以及二者在免疫学上的差异为G-PB和G-BM移植的临床应用提供了免疫学基础［5，6，11，13］。应用多种手段在体内/体外对移植物进行“修饰”，使患者移植后在快速、持久植入和获得GVL的同时，尽可能少发生或不发生严重的GVHD将是我们下一步研究的目标。
【】
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