骨髓增生异常综合征淋巴细胞亚群及其激活状态的分析

       作者：杨隽，王椿，谢匡成，颜式可，高彦荣，

               蔡琦，秦尤文，万理萍，蔡宇

【摘要】  　　本研究探讨骨髓增生异常综合征（MDS）患者外周血T细胞亚群，B细胞，NK细胞数量及激活状态的临床意义。采用流式细胞术对30例MDS患者外周血T细胞，B细胞，NK细胞及其表面活化分子CD28，CD45RA，CD45RO，CD69，HLA-DR的表达进行检测和分析。30例MDS患者中低危组（RA+RAS）22例，高危组(RAEB+RAEBT)8例。结果表明：MDS组T细胞（CD3+细胞）的百分率低于正常对照组，CD4+CD45RA+细胞（未致敏CD4+细胞）的数值低于正常对照组。MSD组早期活化T细胞（CD3+CD69+细胞）和晚期活化T细胞（CD3+HLA-DR+细胞）的数值均显著高于正常对照组。低危组(RA和RAS)主要表现为T细胞活化功能的改变：早期活化T细胞（CD3+CD69+细胞）和晚期活化T细胞（CD3+HLA-DR+细胞）比例均增高，以及B细胞数量的减少。高危组（RAEB和RAEBT）主要表现为T细胞亚群数量的改变：CD3+细胞，CD3+CD4+CD8-细胞(T辅助细胞)数量的减少，CD3+细胞HLA-DR和CD69的表达并不增高。NK细胞数量减少。结论：MDS病人存在有T细胞数量和功能的异常，且随着病情的进展而发生改变，所以T细胞亚群及活化功能的检测对于判断疾病的进程和指导具有重要的意义。

【关键词】  骨髓增生异常综合征；T细胞亚群；B细胞；NK细胞；激活标志

　　Evaluation of the Subsets    of Lymphocytes  and Their Activated Status   in Patients with Myelodysplastic Syndrome 

　　Abstract    This study was purposed to investigate  the clinical significance of the amount and activated status of T cell subsets，B cells，NK cells in peripheral blood from patients with myelodysplastic syndrome (MDS).  The proportion of T cells，B cells，NK cells in peripheral blood from 30 patients with MDS and their surface activation markers of CD28，CD45RA，CD45RO，CD69，HLA-DR were analyzed by flow cytometry. Twenty-two patients were in the low risk group (RA+RAS) while eight patients were in the high risk group (RAEB+RAEBT). The result showed  that the amounts of T cells (CD3+cells) in peripheral blood from patients with MDS were lower than those in control group .The amounts of naived CD4+ cells (CD4+CD45RA+ cells) in MDS patients were lower than those in control. The expression rates of early activation marker (CD69) and late activation marker (HLA-DR) on CD3+ cells in MDS patients were significantly higher than those in control. The abnormalities of the immunologically competent cells were mainly observed in the low risk group (RA+RAS)，and were characterized by the high expression rates of CD69+ and HLA-DR+ on CD3+cells，the decrease of  B cell amounts. The amount abnormalities of T cell subsets were mainly observed in high risk group (RAEB+RAEBT)，and were characterized by the decrease of CD3+ cells and CD3+CD4+CD8-cells (Th cells)    amounts without  high expression of the CD69 and HLA-DR，the decrease of NK cells amounts. It is concluded that there are the abnormalities of T cell subsets and function in the patients with MDS and may change with  disease progression，so the measurement of amonnt and activated status of T cell subsets in peripherat blood from MDS patients can have predictive role for diagnosis of disease progression and guide of therapy.

　　Key words    myelodysplastic syndrome; T cell subset;  B cell; NK cell; activation marker

    骨髓增生异常综合征（MDS）是一组由于造血干细胞突变而引起的恶性克隆增殖性疾病，该病具有异质性，以骨髓无效造血，三系细胞减少和形态学异常为特征。现有的临床资料表明，部分MDS病人用免疫抑制剂（如ATG，环孢菌素） 治疗有效，且MDS和其它各种肿瘤一样，可出现副瘤免疫现象，如血管炎，关节炎，Sweet综合症，Crohns病等。这些免疫紊乱的表现可出现在MDS发病之前、之后或同时发生。以上事实提示了MDS可能与免疫功能异常有关，但确切的机理尚不清楚［1］。本研究通过流式细胞仪三色荧光标记的方法对MDS患者外周血（PB）淋巴细胞功能及激活状态进行了分析，并探讨其临床意义。

　　材料和方法

　　研究对象

　　所有病例均系我院2003年5月至2004年12月住院或门诊的患者，共30例，根据FAB分型，难治性贫血RA 20例，RAS 2例，RAEB 6例，RAEBT 2例。其中女性13例，男性17例，中位年龄58岁（16-87岁），均为初治的病例。将RA和RAS分为低危组，RAEB和RAEBT分为高危组，病人情况详见表1。对照组15例，男性8例，女性7例，为我院工作人员和正常献血者，中位年龄45岁。Table 1. Clinical characteristics of the MDS patients

　　方法

　　取肘静脉血2 ml，2％EDTA-Na2抗凝，然后取抗凝血100  μl，加入放有三色荧光标记单克隆抗体组合(PE/FITC/CY5)的试管：CD3/CD4/CD8，CD3/CD(16+56)/CD19，CD3/CD4/CD28，CD3/CD8/CD28，CD4/CD45RA/CD45RO，CD8/CD45RA/CD45RO，CD3/HLA-DR/CD69（法国Coulter公司），混匀后室温闭光温育30分钟，用Coulter公司Immuno-PREP全血标本处理仪，经配套产品进行溶血，稀释和固定后，4小时内上流式细胞仪检测，配套软件取数和分析，以CD3+细胞设门圈定淋巴细胞进行分析（图1）。每个样本分析20 000个细胞，结果以阳性细胞的百分率（％）表示。

　统计学处理

　　所有资料均采用SPSS  11.5统计软件进行分析。数据经过正态性检验符合正态分布，故采用t检验分析，数据用均数±标准差（X±SD）表示。

　　结 果

　　MDS和对照组外周血中不同淋巴细胞亚群表型比较

　　MDS患者外周血中CD3+细胞（T淋巴细胞）的百分率低于正常对照组(P<0.05)，但绝对值无显著差异（表2），CD3+CD4+CD8-细胞（T辅助细胞）和CD3+CD4-CD8+细胞（细胞毒性/抑制细胞）的百分率和绝对值以及CD4/CD8的比值与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)，其中CD4+CD45RA+细胞（未致敏CD4+细胞）的数值明显低于正常对照组(P<0.01)。CD4+CD45RO+细胞（活化和记忆CD4+细胞）、CD8+CD45RA+（未致敏CD8+细胞）和CD8+CD45RO+（活化和记忆CD8+细胞）的数值与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。CD3-CD19+细胞（B细胞）的数值低于正常对照组。CD3-CD(16+56)+ 细胞（NK细胞）、T细胞共刺激因子的表达（CD3+CD4+CD28+，CD3+CD8+CD28+）与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。早期活化T细胞（CD3+CD69+细胞）和晚期活化T细胞（CD3+HLA-DR+细胞）的绝对值均显著高于正常对照组(P<0.01)。Table 2. Comparison of the expression rates of T cell subsets of each groups （略）

　　低危组和对照组PB中不同淋巴细胞亚群表型比较

　　低危患者PB中CD3+细胞（T淋巴细胞），CD3+CD4+CD8-细胞（T辅助细胞）和CD3+CD4-CD8+细胞（细胞毒性/抑制细胞）的绝对值以及CD4/CD8的比值与正常对照组无显著差异(P>0.05)。但CD4+CD45RA+细胞（未致敏CD4+细胞）的数值低于正常对照组(P<0.01)（图2），CD4+CD45RO+细胞（活化和记忆CD4+细胞）、CD8+CD45RA+（未致敏CD8+细胞）和CD8+CD45RO+（活化和记忆CD8+细胞）的数值与正常对照组无显著差异(P>0.05) （表2）。CD3-CD(16+56)+ 细胞（NK细胞）的数值低于正常对照组。CD3-CD19+细胞（B细胞），T细胞共刺激因子的表达（CD3+CD4+CD28+，CD3+CD8+CD28+）与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。早期活化T细胞（CD3+CD69+细胞）和晚期活化T细胞（CD3+高危组和对照组PB不同淋巴细胞亚群表型比较高危患者PB中CD3+细胞（T淋巴细胞）总数明显低于正常对照组(P<0.01) （表2），CD3+CD4+CD8-细胞（T辅助细胞）绝对值明显低于正常对照组(P<0.05)(图4)，CD3+CD4-CD8+细胞（细胞毒性/抑制细胞）的数值与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)，CD4+CD45RA+细胞（未致敏CD4+细胞）数值明显低于正常对照组(P<0.01)，CD4+CD45RO+细胞（活化和记忆CD4+细胞），CD8+CD45RA+（未致敏CD8+细胞），CD8+CD45RO+（活化和记忆CD8+细胞）的绝对值与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。CD3-CD(16+56)+ 细胞（NK细胞）的绝对值明显低于正常对照组，CD4+细胞共刺激因子的表达（CD3+CD4+CD28+）明显低于正常对照组。CD3-CD19+细胞（B细胞）和 CD3+CD8+CD28+细胞与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。早期活化T细胞（CD3+CD69+细胞）和晚期活化T细胞（CD3+HLA-DR+细胞）的绝对值与正常对照组相比无显著差异(P>0.05)。

　　讨论

　　目前，国内外对MDS免疫功能的研究报道大多数为T淋巴细胞亚群变化的研究，而对细胞的功能状态的研究报道较少见。静止的T细胞只有通过内源性或外源性激活物刺激激活后才能发挥免疫调节和造血调控作用。我们对MDS患者外周血淋巴细胞亚群的检测观察到CD3+细胞的百分率数较正常对照组减少，但CD3+细胞、T辅助细胞（CD3+CD4+CD8-细胞）和T细胞毒性/抑制细胞（CD3+CD4-CD8+细胞）数量无明显改变。我们对MDS病人进一步分组后发现，高危组病人CD3+细胞的总数和T辅助细胞（CD3+CD4+CD8-细胞）数量均低于正常对照组，而低危组病人则与正常对照组无明显差异，这一结果提示MDS患者T淋巴细胞绝对数值的变化可能是MDS恶性转化的前兆。有报道，MDS病人存在NK细胞功能的异常，主要表现为NKT细胞功能的活化［2］，而本研究发现高危组病人NK细胞的数量明显减少，而低危组病人的NK细胞数量无明显异常。此外，低危组病人B细胞的数量是明显低于正常对照组，而高危组病人中无明显差异，这提示低危组病人可能存在有体液免疫的异常。

    CD28是T细胞的表面标记物之一，CD28与它的配体（抗原呈递细胞上的B7）相结合使T细胞活化，一旦T细胞表面不表达CD28，则T细胞将处于无能状态［3，4］。本实验结果显示，高危组病人的CD4阳性细胞CD28的表达明显减少，提示此组病人可能存在有CD4表达的无能。

    根据表达CD45分子的不同，可将T细胞分为CD45RA+细胞（未致敏T细胞）和CD45RO+细胞（活化和记忆T细胞），MDS患者的CD4+CD45RA+细胞数下降，原因可能是在抗原刺激下转化为CD4+CD45RO+细胞［5，6］。

     CD69抗原，也叫早期激活抗原（EA-1），是由同型二聚体组成的Ⅱ型糖基化细胞膜蛋白，属于C-植物凝血素家族，分子量为60  kD，在B淋巴细胞，NK细胞和激活的T细胞上均可表达，在静止的T细胞上不表达，在丝裂原和抗原刺激激活的淋巴细胞表面表达，这是T细胞激活后最早表达的表面抗原［7，8］。HLA-DR属于主要组织相容复合体MHCⅡ类分子，受体是CD4，由α和β两条重链通过非共价键连接分子量分别为34 kD和29 kD，是免疫反应中重要的参与者，在抗原呈递和胸腺选择中起作用，通常表达于免疫系统的细胞，如淋巴细胞和巨噬细胞。HLA-DR在炎性刺激24小时后表达升高，持续数周，MHC限制性是免疫细胞间相互识别和协作的前提，是淋巴细胞激活的晚期标志［9，10］。目前，国内外对MDS淋巴细胞激活方面的研究多数是研究CD25，而对CD69和HLA-DR的研究较少见。本研究观察到MDS低危组患者体内的T细胞CD69和HLA-DR的表达均明显升高，这可能是机体的免疫系统对MDS异常克隆增殖的反应，此反应为持续性的，从而使CD69和HLA-DR的表达升高。而高危组病人CD3+HLA-DR+细胞和CD3+CD69+细胞并不增高，但伴有CD3细胞数量的减少，提示随着疾病的进展T细胞亚群出现功能的异常或机体免疫能力下降。临床上，对早期的病人，尤其是RA病人，由于T细胞处于激活状态，故使用一些免疫抑制剂（如环孢菌素，ATG等）可能对其有效，此实验的结果为免疫抑制剂的临床使用提供了理论的依据。而对于高危期MDS病人由于T细胞的活化功能在疾病的发病中已经不起主要作用，表现为T细胞亚群功能的异常，所以用免疫抑制剂对此类病人可能无效，需要采取更积极的措施（如化疗或骨髓移植等）来防止疾病向白血病转化。

    综上所述，T细胞亚群及活化功能的研究对判断疾病进程，预测疾病的转归，指导临床用药，判断预后具有重要的价值，是目前测定体内免疫功能的最适指标。

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