骨髓移植小鼠骨髓基质细胞内皮抑制素（endostatin）及血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）表达相关性研究

                 作者：吴宁，齐洁琳，张锡芹，周登锋，杨锡贵，

                          王明玉，刘蒲香，孙汉英，刘文励

【摘要】  　　本研究探讨内皮抑制素（endostatin）及血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）在骨髓移植（BMT）小鼠骨髓基质细胞中表达的相关性及川芎嗪对其表达的影响。取健康BALB/c小鼠，随机分为3组：正常组（不做处理），骨髓移植对照组（简称生理盐水组）和骨髓移植+川芎嗪组（简称川芎嗪组）。生理盐水组和川芎嗪组分别胃饲生理盐水0.2毫升/只和川芎嗪注射液每次2毫克/只，2次/天。在BMT后第7、14、21、28天处死小鼠，用间接免疫荧光法和RT-PCR法检测骨髓基质细胞endostatin mRNA及其蛋白、VCAM-1 mRNA及其蛋白的表达情况，并探讨二者表达的相关性。结果表明: endostatin蛋白主要表达于骨髓基质细胞核内，VCAM-1蛋白主要表达于细胞浆内。BMT后第7、14、21天川芎嗪组和生理盐水组endostatin mRNA和蛋白的表达水平显著低于正常组（P<0.01或P<0.05），且川芎嗪组低于生理盐水组（P<0.01或P<0.05）；到第28天生理盐水组已基本恢复正常，而川芎嗪组仍未恢复正常水平。BMT后第7、14、21天川芎嗪组和生理盐水组VCAM-1 mRNA和蛋白的表达均明显低于正常组（P<0.01或P<0?05），且川芎嗪组明显高于生理盐水组（P<0.01或P<0.05），到第28天，川芎嗪组VCAM-1的表达已基本恢复正常，而生理盐水组仍未恢复正常，两组之间有显著性差异（P<0.01）。相关分析显示，生理盐水组骨髓基质细胞endostatin和VCAM-1 mRNA及其蛋白表达呈负相关（P<0.01或P<0?05），而川芎嗪组endostatin和VCAM-1 mRNA及其蛋白表达呈正相关（P<0.01或P<0.05）。结论: 内皮抑制素可通过影响骨髓基质细胞表面VCAM-1的表达水平，阻碍基质细胞与造血细胞之间和细胞外基质与造血细胞之间的联系而影响骨髓造血；川芎嗪能提高BMT小鼠骨髓基质细胞表面黏附分子的表达，加快BMT后HSPC的归巢及在骨髓中的增殖，并通过反馈调节BMT小鼠骨髓基质细胞新血管生成抑制因子内皮抑制素的表达，促进骨髓微环境的修复，加速移植后骨髓的造血重建。

【关键词】  内皮抑制素； VCAM-1； 川芎嗪； 骨髓基质细胞； 骨髓移植

　　Relationship between Endostatin and Vascular Cell Adhesion Mo-lecule-1   Expressions on Bone Marrow Stromal Cells in BMT-mice

　　Abstract    This study was aimed to investigate the relationship between endostatin and  vascular cell adhesion molecule-1  (VCAM-1)  expressions on bone marrow stromal cells (BMSC)   in mice after bone marrow transplantation (BMT)  and effect of ligustrazine  on their expressions. The mice were randomly  divided into 3 groups: normal   group  (without treatment)，saline group (control of BMT) and ligustrazine group (BMT+ligustrazine). BMT mouse models were established. The normal group was not treated，the saline group was given normal saline (0.2 ml/mouse，twice a day ) through gastric tube，while the ligustrazine group was given ligustrazine (0.2 ml/mouse，twice a day) also through gastric tube. On day 7，14，21 and 28 after BMT，mice were killed by euthanasia. The expression levels of endostatin and VCAM-1   in bone marrow stromal cells were detected by immunohistochemistry  and RT-PCR analysis respectively. The results showed that the endostatin protein mainly expressed in nuclei of BMSCs，the VCAM-1 protein mainly expressed in plasma of BMSCs. On day 7，14，21 affter BMT the expression levels of endostatin mRNA and protein in ligustrazin and saline groups  were significantly lower than that in normal group (P<0.01  or   P<0.05)，while their expression levels in ligustrazine group were lower than that in  saline group. On day 28 the expression levels in  saline   group returned to nomal，while the expression levels in   ligustrazine group not were normalized. On   day 7，14，21 after BMT the expression levels  of VCAM-1 mRNA and protein in ligustrazine and saline groups were significantly lower  than that in normal group (P<0.01  or  P<0.05)，but their expression levels in ligustrazine group were significantly ligher than that in saline group  (P<0.01  or  P<0.05).   On day 28 the VCAM-1   expression level in ligustrazine group   returned to normal，while its expression level in saline group not were normalized. The difference between these two groups was significant (P<0.01).  Correlation  analysis revealed that there was a negative correlation between endostation and VCAM-1 expression in saline group，there was a positive correlation between endostatin and VCAM-1 expression in ligustrazine group.  It is concluded that the endostatin can influence hemotopoiesis in bone marrow by effacting VCAM-1  expression on BMSC and hindering connection between stromal cells and hematopoietic cells as well as extracellnlar stroma and hematopoietic cells，while ligustrazine can enhance the adhesion malecule  expression on stromal cell surface of bone marrow in BMT-mice，accelerate the homing and proliferation of HSPC  in bone marrow after BMT，meanwhile can promote the repair of bone marrow microenvinment，accelerate hematopoietic  reconstitution of bone marrow after BMT through feeback regulation of endostatin expression of BMSC in BMT-mice.

　　Key words  Endostatin;VCAM-1; Ligustrazine;  bone marrow stromal cell; bone marrow transplantation

    造血干细胞移植已经成为一种治疗某些血液病和恶性肿瘤及自身免疫性疾病的有效手段。骨髓造血微环境是造血干/祖细胞定居、增殖、分化和成熟的场所，骨髓移植预处理在杀伤造血细胞的同时，也损伤骨髓造血微环境。内皮抑制素（endostatin）是一种血管新生抑制因子，能特异性地抑制血管内皮细胞增生，促进内皮细胞凋亡［1］。黏附分子是介导骨髓基质细胞与造血细胞直接接触的因素之一，通过黏附分子可以传递某些信息以实现骨髓基质细胞与造血细胞的相互作用，在骨髓基质细胞上表达的细胞间黏附分子-1（intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1) 细胞黏附分子在正常或病理状态下的细胞与细胞间黏附中发挥重要作用。目前，有关骨髓造血重建中endostatin与VCAM-1基因表达的相关性研究国内外尚未见报道，本实验应用间接免疫荧光法及RT-PCR技术同步检测BMT后骨髓基质细胞中endostatin与VCAM-1  mRNA及其蛋白的表达，旨在探讨endostatin与VCAM-1在骨髓微环境修复和造血重建中的作用及二者表达的相关性，从而为进一步研究川芎嗪调控造血的作用机制奠定理论与实验基础。

　　材料和方法

　　实验动物

　　清洁级近交系BALB/c小鼠（H-2d，MLSb）8-10周龄，18-22克，雌雄兼用（华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）。每只小鼠于照射前3天到照射后14天以200 U/d的剂量喂庆大霉素水以清洁肠道。

　　药物

　　盐酸川芎嗪注射液20毫克/支（无锡市第七制药厂，批号020822，有效期040822）。

　　试剂和仪器

　　DMEM、胎牛血清（Gibco公司产品）；小鼠抗小鼠endostatin单克隆抗体（Upstatebiotech公司提供）；兔抗小鼠VCAM-1多抗（武汉博士德公司提供）；RT-PCR检测试剂盒（华美生物工程公司提供），CO2细胞培养箱，台式低温高速离心机均为德国Heraeus公司产品；PCR仪（GeneAmp2400）；凝胶成像分析系统（Advanced American Biotech Imaging）。

　　骨髓基质细胞(BMSC)培养

　　分别于BMT后7、14、21、28天处死小鼠，参照Dexter方法［2］进行骨髓基质细胞培养。

　　骨髓基质细胞endostatin、VCAM-1蛋白水平表达的间接免疫荧光检测

　　将上述骨髓有核细胞悬液（细胞浓度2×106/ml）1 ml接种于含有盖玻片的6孔培养板中，置37℃含70 ml/L CO2饱和湿度的CO2培养箱内孵育；待基质形成后，取出细胞爬片；用含0.1% Triton X-100的2%的多聚甲醛4℃固定30分钟；加封闭血清37℃孵育30分钟，加入一抗（小鼠抗小鼠endostatin单克隆抗体，兔抗小鼠VCAM-1多克隆抗体，1∶200/1∶100稀释度）4℃过夜；用PBS液洗涤5分钟，洗2次，加入FITC二抗工作液，37℃避光孵育30分钟；缓冲甘油封片后荧光显微镜下观察。结果判断：细胞核、浆呈现绿色为阳性表达。每张玻片在400倍光镜下随机观察10个不重叠视野，用HPIAS-1000彩色图象分析仪（华中科技大学同济医学院千屏影象公司提供）测定细胞中阳性颗粒的吸光度，取10个视野的平均吸光度值为该玻片上细胞的阳性表达量。

　　骨髓基质细胞endostatin、VCAM-1mRNA水平表达的RT-PCR检测

　　RT-PCR检测参照分子克隆实验指南［3］进行。引物序列：endostatin上游引物：5，-GATGTAGCTGTTGTGGCA-3，下游引物：5，-GTATCCGTGGAGCAGATT-3，。V CAM-1 上游引物：5，-GGAAGCTGGAACGA-AGTATC-3，下游引物：5，-TCCAGAGTCTTCCATCCTCA-3，。用TRIZOL试剂盒按说明提取骨髓基质细胞总RNA并测定纯度。均预变性94℃ 5分钟，变性94℃ 45秒，延伸72℃ 50秒。Endostatin退火59℃ 45秒；VCAM-1退火61℃ 45秒；共30个循环，循环后延伸72℃  7分钟。PCR产物经1%琼脂凝胶电泳检测，用凝胶成像分析系统对DNA条带扫描，以目的基因扫描密度值/β-actin基因扫描密度值的百分数（%）作为目的基因mRNA的相对表达量。Endostatin扩增产物大小为436 bp，VCAM-1扩增产物大小为488 bp，β-actin为283 bp。

　　统计学分析

　　数据以均数±标准差 (X±SD) 表示，采用 SAS 10.0统计软件进行t检验及其相关分析。P<0.05为差异显著。

　　结 果

　　小鼠骨髓基质细胞endostatin及VCAM-1蛋白表达水平的间接免疫荧光检测结果

　　Endostatin蛋白主要表达于骨髓基质细胞核内，VCAM-1蛋白主要表达于基质细胞浆内。BMT后第7、14、21天，间接免疫荧光法检测到川芎嗪组和生理盐水组单个核细胞培养的骨髓基质细胞endostatin的表达水平均明显低于正常组（P<0.01或P<0.05），且川芎嗪组低于生理盐水组（P<0.05）； BMT后第28天生理盐水组已基本恢复正常，而川芎嗪组仍未恢复正常水平(图1）。BMT后第7至21天，川芎嗪组和生理盐水组骨髓基质细胞VCAM-1的表达水平均明显低于正常（P<0?01或P<0?05），川芎嗪组明显高于生理盐水组（P<0.05）；到BMT后第28天川芎嗪组已基本恢复正常，而生理盐水组仍未恢复正常，两组之间有显著性差异（P<0.01）（图2）。

　　小鼠骨髓基质细胞endostatin 及VCAM-1 mRNA表达水平的RT-PCR检测结果BMT后第7至21天川芎嗪组和生理盐水组小鼠骨髓基质细胞endostatin mRNA表达显著下降，随着时dostatin扩增产物为436 bp，VCAM-1扩增产物为488 bp，内参大小为283 bp）。

　　Endostatin与VCAM-1的相关性

　　BMT后骨髓基质细胞endostatin和VCAM-1的蛋白表达相关性  结果如表1所示，BMT后不同时间点生理盐水组骨髓基质细胞endostatin蛋白的表达

　　与VCAM-1蛋白的表达呈负相关，而川芎嗪组骨髓基质细胞endostatin蛋白的表达与VCAM-1蛋白的表达呈显著正相关。Table 1.   Expression correlation betwwen endostatin and VCAM-1 expression  on BMSC in BMT-mice（略）

　　BMT后骨髓基质细胞endostatin和VCAM-1 mRNA表达的相关性  结果如表2所示，BMT后不同时间点生理盐水组骨髓基质细胞endostatin mRNA的表达与VCAM-1呈负相关，而川芎嗪组骨髓基质细胞endostatin mRNA的表达与VCAM-1mRNA的表达呈显著正相关。Table 2.  Endostatin mRNA and VCAM-1  mRNA expressions on BMSCs in BMT-mice（略）

　　讨 论

　　骨髓造血微环境从组织结构上讲主要有基质细胞（stromal cell）、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和造血生长因子3部分组成。微环境中的基质细胞和细胞外基质对HS/PC增殖和分化起着支持、诱导和调控的作用。这种作用可通过分泌的细胞因子，以旁分泌的方式起作用；或是通过细胞表面表达的黏附分子，以邻分泌的方式起作用。骨髓基质细胞是产生调控造血的细胞因子的主要来源，基质细胞产生的负调节因子（negative regulator）对于维持机体造血的动态平衡起着重要的作用［4，5］。Endostatin是一种血管新生抑制因子，能特异性地抑制血管内皮细胞增殖，促进内皮细胞凋亡［1］。VCAM-1属于免疫球蛋白超家族，主要表达在活化内皮细胞、上皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞上，也可在骨髓基质细胞、成纤维样的成滑膜细胞、平滑肌细胞、淋巴组织上表达。它作为VLA-4的配体在造血干/祖细胞归巢中起着重要作用。BMT前的放疗、化疗预处理方案均可损伤骨髓造血微环境，包括基质细胞。

    本实验结果证实：  

　　endostatin及VCAM-1在骨髓基质细胞有不同程度的表达，表明基质细胞可产生分泌endostatin和VCAM-1。BMT后第７、14、21天生理盐水组和川芎嗪组骨髓基质细胞endostatin mRNA及其蛋白的表达水平与VCAM-1 mRNA及其蛋白的表达水平均明显低于正常组，提示骨髓微环境受损，影响骨髓基质细胞分泌细胞因子和黏附分子。BMT后第７、14、21、28天川芎嗪组骨髓基质细胞endostatin mRNA和蛋白的表达水平均低于生理盐水组，提示川芎嗪可通过反馈调节骨髓基质细胞endostatin表达水平，从而改善骨髓微环境促进造血。BMT后第７、14、21、28天川芎嗪组骨髓基质细胞VCAM-1 mRNA和蛋白的表达水平高于生理盐水组，提示川芎嗪通过增强骨髓基质细胞VCAM-1的表达，从而加强骨髓造血细胞与基质细胞及细胞外基质的黏附，促进造血细胞的归巢和迁移。相关分析显示，在急性放射损伤小鼠BMT后，生理盐水组endostatin不仅在蛋白水平的表达与VCAM-1蛋白的表达呈负相关，而且其mRNA的表达量也与VCAM-1 mRNA表达呈显著负相关，而川芎嗪组endostatin mRNA及其蛋白的表达与VCAM-1的表达呈显著正相关。这一结果提示endostatin可通过影响骨髓基质细胞表面VCAM-1的表达水平，从而阻碍基质细胞与造血细胞之间和细胞外基质与造血细胞之间的联系而影响骨髓造血；而川芎嗪不但能提高BMT小鼠骨髓基质细胞黏附分子的表达，加快BMT后HSPC的归巢及在骨髓中的增殖，而且能通过反馈调节BMT小鼠骨髓基质细胞新生血管生成抑制因子endostatin的表达，促进骨髓微环境的修复，加速移植后骨髓的造血重建。

【】
  　　1 Dhanabal M，Ramchandran R，Waterman MJ，et al. Endostatin induce endothelial cell apoptosis. J Biol Chem，1999; 274:11721-11726

　　2 Dexter TM，Moore MAS，Sheridan APC. Maintenance of hematopoietic stem cells and production of differentiated progeny in allogeneic and semiallogeneic bone marrow chimeras in vitro. J Exp Med，1997; 145:1612-1616

　　3 萨姆布鲁克主编，黄培堂等译. 分子克隆实验指南 . 第二版，北京：出版社. 1993; 465-467

　　4 林治栋. 骨髓基质细胞及其辐射残留损伤. 国外医学·放射医学核医学分册，2001; 25：282-284

　　5 Kincade PW，Lee G，Pietrangeeli CE，et al. Cells and molecules that regulate B lymphoiesis in bone marrow. Annu Rev Immunol，1989; 7:111-143.