多发性骨髓瘤、急性白血病患者骨髓基质细胞的生长、免疫表型及白介素6的水平
作者：庄俊玲，汪玄，张洁萍，武永吉
【摘要】 为了研究多发性骨髓瘤（MM）及急性白血病（AL）骨髓基质细胞（BMSC）的生长速度、免疫表型及白介素6（IL-6）水平，应用骨髓贴壁细胞培养法培养BMSC观察细胞的生长速度；用流式细胞术测定免疫表型、细胞周期；用ELISA方法测定BMSC培养体系中IL-6的水平。结果表明，AL患者原代BMSC的生长时间（17.3±7.8天）和传代周期（10.3±3.5天）均显著短于MM患者（分别为26.5±6.3天和16.5±4.1天）和正常人（分别为25.8±6.3天和17.5±2.4天），AL患者BMSC细胞周期S+G2%（17.4±3.6%）显著高于MM患者（8.5±2.2%）和正常人（8.9±2.3%）。3组中CD29、CD44均为100%表达，而CD138、CD34、CD54、CD56均不表达，CD106在3组中均部分阳性。在3组BMSC上清中，IL-6水平在MM组（1 288.5±736.7 pg/ml）显著高于AL组患者（859.3±203.1 pg/ml）和正常人组（850.9±129.5 pg/ml）。结论：MM、AL患者和正常人BMSC的生长速度、细胞周期中S+G2%和IL-6水平存在显著差异，所检测的抗原表达无差异。
【关键词】 多发性骨髓瘤；急性白血病；骨髓基质细胞；免疫表型；白介素6
Growth，Immunophenotype and Interleukin-6 Level of Bone Marrow Stromal Cells in Patients with Multiple Myeloma and Acute Leukemia
Abstract The aim of this study was to investigate the growth，immunophenotype and interleukin-6 (IL-6) level of bone marrow stromal cells (BMSC) in patients with acute leukemia (AL) and multiple myeloma (MM). BMSC was cultured by wall-adhesion method and the growth of BMSC was observed. The immunophenotype and cell cycle of BMSC were detected by flow cytometry. The level of interleukin 6 (IL-6) in BMSC culture system was detected by ELISA. The results showed that the primary （17.3±7.8 days）and continuous （10.3±3.5 days）growth cycle of BMSC in patients with AL were significantly shorter than those in patients with MM (26.5±6.3 and 16.5±4.1 days respectively)， and shorter than those in normal controls (25.8±6.3 and 17.5±2.4 days) respectively. Similarly，S+G2%（17.4±3.6%）of BMSC in patients with AL was significantly higher than those in patients with MM（8.5±2.2%）and in normal controls（8.9±2.3%）. All of the three groups showed positive antigen expressions with CD29 and CD44 were 100%，while CD138，CD34，CD54，CD56 positive were not expressed and CD106 was partially expressed positive. The supernatant IL-6 level of BMSC system in MM patients （1288.5±736.7 pg/ml）was significantly higher than those in AL patients（859.3±203.1 pg/ml）and normal controls（850.9±129.5 pg/ml）. It is concluded that the growth，S+G2% of cell cycle and IL-6 level of BMSC in patients with MM，AL and normal control are significantly different，whereas the antigen expressions are similar.
Key words multiple myeloma; acute leukemia; bone marrow stromal cell；immunophenotype； interleukin-6
血液系统恶性肿瘤的生物学行为，例如溶骨或发生髓外浸润都与黏附分子的表达变化以及和基质细胞的相互作用有关。本研究探讨多发性骨髓瘤（MM），急性白血病（AL）及正常骨髓基质细胞（BMSC）在生长速度、免疫表型及IL-6分泌等方面的差异，旨在揭示BMSC在血液系统恶性肿瘤发病机制所起的可能作用。
材料和方法
标本采集
抽取19例MM 患者、12 例AL 初治患者 及6名正常人骨髓15-20 ml，肝素抗凝，加Ficoll液，400× g梯度离心30分钟。分离单个核细胞（MNC）。
BMSC培养
参照加以改良，培养体系中含有MEM培养液，20％胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/ml，2 mmol/L 谷氨酰胺。骨髓单个核细胞以1×106/ml浓度种于25 ml培养瓶中，每例2瓶，每瓶5 ml。置于37°C、饱和湿度、5% CO2条件下培养24小时后弃上清及非贴壁细胞，每周换液1次，直至贴壁细胞铺满瓶底。每例取2瓶铺满瓶底时间的平均值。
BMSC传代
以0.25％胰酶-EDTA数滴覆盖细胞层，于37°C培养箱中消化3-5分钟，转移至离心管中，加PBS后300×g离心10分钟。一部分按1×104/ml浓度重新种于25 ml培养瓶中，需要再次传代的时间。另外留取至少1×105个基质细胞进行细胞周期测定。
BMSC免疫表型测定
应用FACSort流式细胞仪（Becton Dickinson）中的CellQuest 软件检测，以细胞群表达某种抗原超过20%计为阳性。单抗中抗CD11a-FITC购自天津协和干细胞公司，抗CD29-FITC和抗CD54-FITC 购自Santa Cruz公司，抗CD49d-PE购自Ebioscience公司，抗CD138-FITC购自Serotec公司，其他抗体均购自Becton Dickinson公司，包括抗CD44-PE，抗CD56-PE，抗CD106-PE，抗CD34-FITC，抗CD38-PE。
BMSC细胞周期测定
2×105个BMSC以70％乙醇固定24小时后，300 ×g离心5分钟后弃上清。加入PBS 5 ml离心洗2次。弃上清后加入RNase A（终浓度为60 μg/ml），摇匀，37℃温育30分钟，加入荧光染料溴化乙锭 (PI，终浓度为50 μg/ml)，4℃暗染30分钟，以30 μm滤膜过滤细胞。用Coulter EPICS XL型流式细胞仪测定，以S＋G2%表示细胞群的DNA合成速度，同时做正常二倍体对照组。
BMSC IL-6水平测定
用ELISA法（GeneMay公司试剂盒）测定BMSC铺满瓶底后上清培养基中的IL-6水平。
统计学方法
统计数据以均数±标准差（X±SD）表示，两两均数采用等方差两样本t检验。
结 果
MM、AL和正常人BMSC生长比较
本研究得出的结果表明，AL患者原代BMSC铺满瓶底的时间和再次传代的周期显著短于MM患者和正常人（P<0.05），后二者之间无显著差异（P值分别为0.82和0.70）。MM组内初治/进展和稳定患者之间原代细胞生长和传代周期之间无显著差异(P值分别为0.77和0.66)，而AL组内初治患者的原代细胞生长（P<0.01）和传代时间（P=0.02）均显著短于缓解期患者。AL组S+G2%显著高于MM和正常人（P<0.01），而MM和正常人两组之间无显著差异（P=0.75）（表1，附图）。Table 1. Growth of BMSCs in patients with MM，AL and normal controls（略）
MM、AL、正常人BMSC免疫表型特点
3组中CD29（整合蛋白β1）、CD44（HCAM）均100%表达，CD138、CD34、CD54（ICAM-1）、CD56（NCAM）均不表达。CD106（VCAM-1）在3组均部分阳性，经统计学检验无显著差异（P>0.05）。MM组CD11a和CD49d各有1例阳性，AL和正常人组均为阴性(表2)。Table 2. Immunophenotype of BMSC in patients with MM，AL and normal controls（略）
MM、AL、正常人BMSC IL-6分泌
3组BMSC上清中IL-6水平在MM组显著高于其他两组(P<0.05)，而AL组和正常人组IL-6水平无显著差异(P>0.05)。MM组中初治/进展期患者的IL-6又显著高于稳定期患者（P=0.02）（表3）。Table 3. IL-6 levels of BMSCs in MM，AL and normal controls（略）
讨论
造血系统恶性肿瘤的发生和增殖与BMSC（或称为辅助细胞）及其分泌的各种细胞因子之间有着密切的关系，但基质微环境在促成肿瘤发生的过程中到底起多大的作用目前所知甚少。一些致力于研究骨髓基质微环境的学者发现，白血病患者的BMSC在组成和功能上均与正常BMSC不同［1，2］，甚至一部分患者的基质细胞有着和白血病细胞同样的细胞遗传学异常［3］。因此认为BMSC和造血干细胞可能来源于同一种更为前体的干细胞。
BMSC包括纤维母细胞（约占60%-70%）、巨噬细胞（约占10%-15%）、破骨细胞及脂肪细胞等［4］。早期对MM BMSC的研究发现，它与正常人BMSC一样，纤维母细胞是主要成分，但MM患者的BMSC中细胞外基质蛋白（包括纤连蛋白、层粘连蛋白和Ⅳ型胶原）却显著下降，而且在体外可以支持单克隆B细胞系的生长，因此作者认为MM BMSC和正常BMSC存在着本质差异［4］。
我们的研究发现，MM患者和正常人BMSC的生长速度（包括原代细胞培养时间和传代周期）和细胞周期测定的S+G2期比例无显著差异，而急性白血病患者基质细胞的生长速度显著比二者快，S+G2%也显著升高，说明细胞合成倍增的速度加快。三者生长速度不同表明，它们的结构和生物学特点有着本质的差异，推测决定BMSC生长的主要原因仍是疾病本身。Bhatia等［5］发现，慢性粒细胞白血病（CML）患者BMSC不支持正常造血，而且存在bcr-abl阳性细胞。但近期国内有报道，CML患者的BMSC核型和超微结构均正常，PCR也未检测到bcr/abl基因表达，因此认为CML患者的BMSC没有肿瘤源性［6］。
另外，本研究结果显示，虽然MM患者基质细胞的生长与正常人比较无显著差异，但其IL-6的分泌却显著高于正常人BMSC，这与国外报道的结果类似。Wallace等［7］发现，5×105个MM BMSC中IL-6水平为16.3×103 pg/ml，而相同数目的正常人BMSC中仅为8.3×103 pg/ml，而且初治MM患者BMSC生长速度虽然与缓解期患者无差异，但IL-6的水平却显著升高。这进一步说明，MM患者的BMSC与正常BMSC有着本质的不同，而且有效的不仅能够抑制瘤细胞生长，同时还能够降低基质细胞分泌IL-6，如同缓解期白血病患者的BMSC生长比初治患者减慢一样［7］。
黄科等［8］研究了不同年龄段骨髓间充质干细胞（MSC）的生物学特点，结果表明各年龄段MSC形态、抗原表达和细胞周期基本相似，而0-20岁组骨髓原代MSC的传代周期最短，是移植供者的最佳选择。我们也注意到了BMSC生长速度与年龄的关系，本研究中虽未进行统计学比较，但MM患者年龄较大，而正常对照和AL患者基本相当，因此不能用年龄差别解释正常和AL BMSC生长之间的差异。
我们比较了3组BMSC的抗原表达，结果显示，检测细胞基本呈均一的一群，抗原表达也比较一致。干细胞标志的CD34在3组细胞中均为阴性，CD38也为阴性，几乎所有骨髓瘤细胞都表达的CD138在基质细胞均为阴性。几种黏附分子的表达在3组中基本没有显著差异，这与其他报道类似。Mareschi 等［9］检测结果显示，BMSC高表达CD90、 CD29、 CD44和CD105、 CD166和CD106部分表达，与各系分化相关的抗原包括CD45、 CD3、 CD19、 CD33、 HLA-DR等表达也均为阴性［10］。关于其他疾病如再生障碍性贫血（AA）、骨髓异常增生综合征（MDS）患者BMSC的免疫表型也有报道，均与正常对照相似［11，12］。
本研究评价了正常人与MM，AL患者BMSC的生长、免疫表型及细胞因子等方面的差异，说明BMSC异常与血液系统肿瘤的发病有一定关系。同时在揭示疾病发病机理方面提供了一些证据，为今后进一步的深入研究提供了基础。
【】
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