儿童急性淋巴细胞白血病伴有TEL-AML1融合基因表达的免疫表型特点分析
作者：刘怡，李志刚，赵玮，李蓓，巩文玉，吴敏媛
【摘要】 为了探讨伴有TEL-AML1融合基因表达的儿童急性淋巴细胞白血病（ALL ）的免疫表型及其它临床特点，采用三色流式细胞术（FCM）检测免疫表型，用巢式逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TEL-AML1融合基因的表达；同时在 FAB分型基础之上进行形态学（M）、免疫学（I）、细胞遗传学（C）分型。结果显示：①儿童B系ALL中TEL-AML1+占18.5%(22/119)，主要以L2亚型为主，糖原（PAS）染色阳性率和积分值均数分别为65%和121，均高于TEL-AML1-组（P<0.05）；②与儿童B系ALL TEL-AML1-组相比，TEL-AML1+年龄、性别、白细胞计数、外周血中幼稚细胞数目均未见有统计学差异；③TEL/AML1+组中，普通淋巴细胞表型占95.5%(21/22)；与TEL/AML1-组比较，CD13表达率增高（59.1%，13/22），CD20表达率减低（22.7%，5/22）（P<0.05）；CD10及HLA-DR的平均荧光指数（MFI值）增高，分别为92.80及53.61（P<0.05）。结论：儿童伴TEL-AML1融合基因表达在儿童ALL中较常见，且具有特殊的免疫表型特点，该特点可作为儿童白血病微量残留病的辅助检测。
【关键词】 急性淋巴细胞白血病； TEL-AML1融合基因；免疫表型
Immunophenotypic Characteristics of Children with Acute Lymphoblastic Leukemia Carrying TEL-AML1 Fusion Gene
Abstract To investigate the immunological and other clinical characteristics in TEL/AML1+ childhood B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL)，immunophenotyping was performed with three-color flow cytometry，and the expression of TEL-AML1 fusion gene was detected with nested RT-PCR. Diagnosis was made according to FAB and MIC criteria. The results showed that (1) among 119 children with B-ALL，22 (18.5%) were TEL-AML1 positive and classified as L2 morphological subtype. In TEL-AML1+ group，positive rate and score of PAS，which were 65% and 121 respectively，were all higher than that of TEL-AML1-group (P<0.05)； (2) compared with TEL-AML1-group，no significant difference was found in age，gender，white cell count and blasts count in peripheral blood of TEL-AML1+; (3) in TEL-AML1+ group，21 out of 22 (95.5%) were common ALL，as compared with TEL-AML1-group，the positive rate of CD13 was higher (59.1%， 13/22) and the positive rate of CD20 was lower (22.7%， 5/22) than that in TEL-AML1-group，respectively (P<0.05)， and the mean fluorescence index of CD10 and HLA-DR significantly increased to 92.80 and 53.61，respectively (P<0.05). It is concluded that TEL-AML1 rearrangement is a frequent molecular abnormality in childhood ALL. Leukemic blasts with this anomaly have special immunophenotypic characteristics. These characteristics may be useful in detection of minimal residual leukemia.
Key words acute; lymphoblastic leukemia; gene fusion; TEL-AML1; immunophenotype
急性淋巴细胞白血病(ALL)约占儿童白血病的75%，其中伴有TEL-AML1融合基因表达的患儿约占B系ALL的16%-36%［1］。由于染色体易位t（12；21）（p13；q22），导致位于12p13的基因和位于21q22的AML1基因融合而形成TEL-AML1融合基因。我们应用RT-PCR的方法在119名B系ALL患儿中共检测出22例TEL-AML1+患儿，并与同期收治B系ALL且无TEL-AML1融合基因及其它基因异常者进行了分析比较，以探讨儿童ALL伴TEL-AML1融合基因表达的免疫学、生物学等特点。
材料和方法
病人
对2003年1月至2004年5月在我院收治初诊的白血病患儿进行FAB分型、免疫分型及融合基因的检测，共检测B系ALL 119例，其中TEL-AML1+（以下简称阳性组）22例，男性12例，女性10例，年龄1岁9月-10岁（中位年龄4岁）。阴性组为同期收治的38例B系ALL，且未检测到异常融合基因，（以下简称阴性组），其中男性26例，女性12例，年龄1岁8月-16岁（中位年龄4岁1月）。
形态学检查
骨髓及血涂片经瑞氏染色分类，同时进行细胞化学染色，包括髓过氧化物酶(POX)、萘酚AS-D醋酸脂酶(a-NAE)及氟化钠抑制试验(NaF)、萘酚AS-D氯醋酸脂酶染色(AS-Cl)、糖原染色(PAS)，染色方法按本室常规方法进行［2］。
免疫学检查
取EDTA抗凝骨髓2 ml（标本中原始及幼稚细胞≥30%），分离单个核细胞，用三色免疫荧光标记法(FITC/PE/CD45-PC5)于流式细胞仪（FACS Calibur，Becton Dickinson公司产品）分析。所用抗体包括FITC标记的MsIgG1（同型对照）、CD10、CD33、CD7、HLA-DR、CD2、Kappa、Lambda、CD20、MPO、cyIgM；PE标记的MsIgG1（同型对照）、CD22、CD34、CD41、CD5、CD117、CD19、CD13、CD170、cyCD79a、cyCD3；Cy-5标记的CD45。以上抗体主要购于法国Immunotech公司，少数购于美国PharMingen公司。阳性判断标准：淋系抗原阳性细胞≥30%，髓系抗原阳性细胞≥20%，胞浆染色抗原阳性细胞≥10%，干/祖细胞抗原阳性细胞≥20%。分型标准依据欧洲急性淋巴细胞白血病免疫分型组的积分标准（EGIL）。
TEL-AML1融合基因的巢式RT-PCR方法检测
引物
采用巢式RT-PCR方法，RT 反应引物ABL-3，序列为5′-GCTGCCATTGAT-3′。第1轮PCR反应引物BCR-1、BCR-2和ABL-1的序列分别为5′-CGCTC TCCCTCGCAGAACT-3′，5′-GAGTCACTGCTGCTGCT TATGTC-3′和5′-TTTTGGTTTGGGCTTCACAC-3′。第2轮PCR反应引物BCR-3、BCR-4和ABL-2的序列分别为5′-ACTGCCCGGTTGTCGTGTC-3′，5′-CACGT TCCTGATCTCCTCTGAC-3′和5′-ACACCATTCCCCA TTGTGATTAT-3′。
RNA提取 按照TRIzoL产品说明书进行。
逆转录反应 按照MMLV逆转录酶产品说明书，将细胞总RNA逆转录为cDNA。
PCR反应 25 μl反应体系，含10×buffer 2.5 μl，dNTP 0.2 mmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，引物各5 pmol，Taq DNA聚合酶1.25 U。95℃预变性 5分钟，95℃ 变性30秒，58℃ 退火30秒，72℃延伸 1分钟。第1轮PCR反应25个循环，第2轮PCR反应20个循环，最后72℃延伸10分钟结束反应。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色 按本室常规方法进行。
染色体检查
取肝素抗凝骨髓2 ml，直接法或24小时培养法处理标本，采用G显带方法，根据国际人类染色体命名法（ISN1995年）命名核型。
统计学分析
应用SPSS 10.0软件进行相关分析，t检验及χ2检验。
结果
临床血液学特点
阳性组中外周血白细胞数（2.3-45.0）×109，外周血幼稚细胞数0.06-0.93。阴性组中外周血白细胞数（1.8-145.0）×109，外周血幼稚细胞数0.01-0.93。在年龄、性别、白细胞数、外周血幼稚细胞数方面，两组之间未见有统计学差异。
形态学及组织化学染色结果
阳性组22例中2例为L1型，15例为L2型（68.2%），5例为L3型。阴性组38例中6例为L1型，27例为L2型（71.1%）。5例为L3型。阳性组及阴性组的POX染色、AS-D酯酶、a-NAE染色及NaF抑制试验均为阴性，阳性组PAS染色的阳性率和积分值均数分别为65%和121，均高于阴性组的34%和59（P值分别为0.020及0.044），有显著性差异。
免疫表型检测结果
阳性组中21例为普通B淋巴细胞型，占95.5%；1例为T、B系混合免疫表型，除表达B 系相关抗原外，还表达：CD5、CD7。
阳性组与阴性组各种抗体表达率见表1。由表1可见，阳性组中CD13的表达率增高 （59.1%，13/22），CD20表达率减低 （22.7%，5/22），与阴性组比较均有显著性差异。其它抗体表达未见与阴性组有显著差异。阳性组与阴性组的抗体平均荧光指数（MFI值）结果见表2。由表2可见，阳性组与阴性组中细胞平均荧光指数（MFI值）的结果比较，其中：阳性组中CD10及HLA-DR的MFI值增高，与阴性组比较有显著性差异（P<0.05）；CD13的MFI值增高，但未见有统计学差异。Table 1. Comparison of CD antigen expressions of leukemic cells in bone marrow detected by flow cytometry between children with TEL-AML1+ ALL and TEL-AML1-ALL（略）Table 2. Comparison of mean fluorescence index（MFI）of leukemic cells in bone marrow detected by flow cytometry between children with TEL-AML1+ ALL and TEL-AML1-ALL （略）
融合基因检测结果
在119例儿童B系ALL中，应用巢式RT-PCR方法检测出ALL伴 TEL-AML1+患儿22例，占18.5%。
染色体检查结果
阳性组中有15例进行核型分析，其中4例未见中期分裂相，而11例中二倍体4例，假二倍体3例，亚二倍体2例，超二倍体2例，但均未检测到t（12；21）易位。
讨 论
由于t（12；21）的隐蔽性，应用传统的核型分析方法对其的检出率不足0.05%。随着PCR及FISH技术的应用，检测染色体t（12；21）的改变是导致TEL-AML1融合基因的形成的主要原因［3，4］。
通过比较分析，我们发现儿童ALL伴TEL-AML1+患儿主要以L2亚型为主，伴有PAS染色的增强。并具有独特的免疫表型特点：主要以普通B淋巴细胞表型为主，前B及成熟B淋巴细胞表型少见；CD13表达率增高；CD20表达率减低。该结果与Baruchel等［5］研究结果相似，即TEL-AML1+患者常伴有髓系（CD13和/或CD33）抗原表达及CD20的低表达。研究结果表明，儿童ALL伴TEL-AML1+免疫表型的另一特点是CD10及HLA-DR的MFI值增高。这一结论与De Zen等［6］报道相似。这一特点也可作为ALL伴TEL-AML1+患儿微小残留病（MRD）的一项检测指标。CD10是一种Ⅱ型结构膜蛋白，已证实为人类膜相关中性肽链内切酶，它表达于早期未定型的淋巴前体细胞，在生发中心被激活和增殖的B细胞均可表达。HLA-DR分子见于B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞及胸腺上皮细胞，该分子参与各种免疫活性细胞的互相作用。在白血病发生过程中，造血干细胞转化时在其克隆扩增的过程中常会伴有生长及分化异常，从而导致该类白血病细胞具有特殊的表型特点。De Zen等还发现，TEL-AML1+患者常伴有CD45的低表达，但本组患儿未发现有此特点。
应用RT-PCR方法对TEL-AML1融合基因检测，检出的阳性率高于传统核型分析，这一方法与其免疫分型特点分析结合，可快速准确地检测出微小残留病，为临床提供依据及监测缓解情况。
【】
1 Romana SP，Mauchouffe M，Le-Coniat M，et al. The t(12;21) of acute lymphoblastic leukemia results in a TEL-AML1 gene fusion. Blood，1995; 85: 3662-3670
2 叶应妩，王毓三主编. 全国临床检验操作规程. 南京：东南大学出版社，1991：68-75
3 Trka J，Zuna J，Hrusak O，et al. Impact of TEL-AML1-positive patients on age distribution of childhood acute lymphoblastic leukemia in Czech Republic. Pediatric Hematology Working Group in Czech Republic. Leukemia，1998; 20: 996-997
4 林冬，刘世和，竺晓凡等. t（12；21）儿童急性淋巴细胞白血病的研究. 中华血液学杂志，2004; 25: 17-21
5 Baruchel A，Cayuela JM，Ballerini P，et al. The majority of myeloid-antigen-positive (My+) childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukaemias express TEL-AML1 fusion transcripts. Br J Haematol，1997;99 : 101-106
6 De-Zen L，Orfao A，Cazzaniga G，et al. Quantitative multiparametric immunophenotyping in acute lymphoblastic leukemia: correlation with specific genotype. 1. ETV6/AML1 ALLs identification. Leukemia，2000;14: 1225-1231.
