哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡与胱冬酶-3及bcl-2基因家族的关系
作者：熊安秀，王敏， 金润铭， 白燕， 林雯
【摘要】 本研究探讨哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡及其机制。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法观察哇巴因对Jurkat细胞生长的抑制作用，应用流式细胞术、原位末端标记技术（TUNEL）等观察细胞凋亡，应用Western-blot测定胱冬酶-3（caspase-3）的活性亚单位及Bcl-2、Bax蛋白表达水平，用比色法检测caspase-3活性。结果表明：哇巴因能诱导Jurkat细胞凋亡，在细胞凋亡过程中， Bax蛋白表达增加，caspase-3活性明显升高。结论：哇巴因可能通过调节Bcl-2、Bax蛋白表达，从而激活caspase途径诱导Jurkat细胞凋亡。
【关键词】 哇巴因；Jurkat细胞； 细胞凋亡； Bcl-2； Bax； caspase-3
Ouabain-induced Apoptosis of Jurkat Cells Correlates with Acti-vation of caspase-3 and Regulation of bcl-2 Gene Family
Department of Pediatrics, Yichang Central Hospital, The First Clinical Medical College of Sanxia University, Yichang 443003, China; 1Department of Pediatrics, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430022, China
AbstractThe study was aimed to explore the apoptosis effect of ouabain on Jurkat cells and its mechanism. MTT method was used to observe the inhibitory effect of ouabain on Jurkat cell proliferation. Apoptosis was detected by using flow cytometry(FCM) and the terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end-labeling reaction method (TUNEL). The protein expressions of Bax, Bcl-2 and active subunits of caspase-3 were measured by Western blot. Activities of caspase-3 were determined by colorimetry method. The results showed that ouabain could induce apoptosis of Jurkat cells, the expression of Bax protein in process of cell apoptosis, caspase-3 activity of Jurkat cells were remarkably enhanced after ouabain treatment. It is concluded that ouabain may induce apoptosis of Jurkat cells due to the activation of caspase-3 resulting from regulation of Bax protein and bcl-2 gene expressions.
Key wordsouabain; Jurkat cell; apoptosis; Bcl-2; Bax; caspase-3
内源性哇巴因（endogenous ouabain,EO）是由肾上腺皮质分泌的一种类固醇激素，为特异的钠钾三磷酸腺苷转移酶(Na+-K+ATPase)抑制剂，具有调节水钠代谢、血管收缩和心肌收缩等重要的生理功能。最近研究表明，哇巴因对细胞具有促进增殖和诱导细胞凋亡的双重效应［1,2］，诱导细胞增殖和凋亡的信号传导［3］，但对哇巴因诱导细胞凋亡的机制目前仍未彻底阐明。据此，我们以白血病细胞株Jurkat为体外模型，探讨了Bcl-2、Bax和 caspase-3在哇巴因诱导细胞凋亡过程中的作用。
材料和方法
细胞系及培养
白血病细胞株Jurkat引自典型培养物保藏中心，采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。实验选用对数生长期细胞。
药品及试剂
四甲基偶氮唑盐（MTT）、哇巴因购自Sigma公司；细胞凋亡原位检测试剂盒为德国Boehringer Mannheins公司产品；鼠抗人Bcl-2、Bax单克隆抗体、兔抗人caspase-3多克隆抗体购自Santa Cruz 公司； caspase-3活性检测试剂盒购自Clontech公司。
细胞生长抑制分析（MTT法）
接种细胞于96孔板，实验体系总体积为180 μl，细胞终浓度为1×106/ml，加入不同浓度的哇巴因（1、10、50、100 μmol/L）培养24小时，加入20 μl MTT（5 g/L）后继续培养4小时，去上清加入200 μl二甲亚枫（DMSO），用BIO-TEK酶标仪测定吸光度（A）值（OD值），每个浓度设3个复孔，完全培养液和磷酸盐缓冲液分别作为空白对照和阴性对照。细胞生长的抑制率按下式：增殖抑制率=（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%
细胞凋亡的TUNEL法检测
收集对照组及哇巴因处理组的细胞，调细胞浓度为1×106/ml，取100 μl细胞悬液经LTP-B离心涂片机甩片，室温稍干燥后用4%多聚甲醛4 ℃固定15分钟，依试剂盒说明书依次加入封闭液、透化液、50 μl TUNEL反应液、50 μl AP转换液和50 μl BCIP/NBT底物液测定细胞凋亡，设不加TdT酶为阴性对照。光学显微镜高倍镜（×400）下观察，计数200个细胞，细胞染成致密蓝色者为阳性细胞，即调亡细胞，计算阳性表达率（%），共计数3次，取平均值。
细胞凋亡的PI染色分析
收集1×106个细胞于离心管中， 1 000×g离心5分钟，用预冷PBS洗1次，70%冰乙醇（-20℃）固定，-20℃保存，检测前离心去除固定液，加入含有10 μg/ml的PI和0.1% RNase A的PBS，室温闭光染色30分钟，上流式细胞仪检测，记录激发波长488 nm处的红色荧光，然后经ModFitLTR软件收集、储存和分析，每份标本检测10 000个细胞，凋亡百分率用百分数表示。
Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达的Western blot测定
取对照组和哇巴因组细胞各1×107个，加入预冷的细胞裂解液200 μl，冰上裂解20分钟， 1 200×g离心10分钟取上清，测蛋白浓度，每份样品取50 μg蛋白进行10% SDS-PAGE，并转移至硝酸纤维素膜上，经4% BSA封闭后，分别与抗Bcl-2、Bax单克隆抗体、抗caspase-3多克隆抗体作用，用碱性磷酸酶标记二抗和BCIP/NBT底物显色，图像由Gelworks ID软件分析。
Caspase-3活性的比色法检测
分别收集对照组和50 μmol/L哇巴因作用不同时间(5、10、15、20、25、30小时)的细胞2×106个，caspase-3活性是依据底物DEVD-pNA被蛋白水解酶分解后的pNA在405 nm处的吸光值测定的，按试剂盒说明书操作测定吸光值以表示caspase-3相对活性。
结果
哇巴因对Jurkat细胞增殖的影响
将系列浓度的哇巴因（1、10、50、100 μmol/L）分别与Jurkat细胞一起孵育24小时，细胞生长抑制率分别为33.4%、45.7%、50.4%和63.7%，细胞生长抑制率与哇巴因浓度呈正相关。
哇巴因对Jurkat细胞凋亡的影响
FCM分析表明：所有受检标本显示有DNA低含量颗粒（"亚G1期峰"），系列浓度的哇巴因（10、50、100 μmol/L）处理Jurkat细胞12小时，细胞的凋亡率分别为7.20%、15.01%、24.90%，对照组为3?10%，显示出浓度依赖效应。
哇巴因对Jurkat细胞凋亡的影响
TUNEL法检测结果显示，未经哇巴因处理细胞的凋亡百分率为(3.667±0.577)%， 50 μmol/L哇巴因处理Jurkat细胞8、16、24小时，凋亡细胞百分率分别为：(9.667±1.523) %、(17.667±2.517) %和(25.667±2.082) %，与对照组比较，差异有显著性（P<0.01）；不同浓度（1、10、50、100 μmol/L）哇巴因作用Jurkat细胞24小时，凋亡细胞百分率分别为：(9.333±0.577) %、(16.667±1.523) %、(26.334±1.528) %和(40.668±2.512) %，与对照组比较，差异有显著性（P<0.01），诱导凋亡作用随哇巴因浓度的升高和作用时间的延长而加强。
哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡时Bcl-2、Bax蛋白的表达变化
Jurkat细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达采用Bcl-2、Bax与β-actin积分吸光度比值来表示，未处理的Jurkat细胞均有Bcl-2、Bax蛋白的表达，系列浓度的哇巴因（1、10、50 μmol/L）作用于Jurkat细胞24小时，用药前后Bcl-2蛋白的表达无明显改变，而Bax蛋白表达用药后明显增高，呈浓度依赖趋势，差异有显著性（P<0.01）（图1，附表）。Table . Expression of Bcl-2、Bax protein after ouabain treatment (略)
哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡时caspase-3蛋白表达及活性的变化
Caspase-3蛋白表达的变化图2显示，Jurkat细胞经哇巴因处理24小时后，可见17 kD的caspase-3活性亚单位(p17)。活性亚单位的出现表明caspase-3酶原被激活。
Caspase-3活性的变化哇巴因处理Jurkat细胞5小时即出现
caspase-3活性增高，处理25小时caspase-3活性达高峰，为未处理前的4.59倍，30小时caspase-3活性下降。对照组caspase-3活性升高幅度不明显（图3）。
讨论
细胞凋亡是在基因控制和酶促反应下按一定程序进行的细胞主动死亡过程。bcl-2基因家族是细胞凋亡的重要调控基因，该家族成员对凋亡的调控作用主要位于蛋白水平，各成员之间通过形成二聚体的形式发挥作用，大多数Bcl-2家族蛋白既能形成同二聚体，也能和其它Bcl-2家族蛋白形成异二聚体，相互作用或通过不同的机制，正负调控细胞凋亡。近来研究显示，细胞受到刺激后是否凋亡取决于Bcl-2/Bax的比率［4］。本实验结果显示，哇巴因诱导凋亡作用随药物浓度的升高和作用时间的延长而加强，在未处理的Jurkat细胞均有Bcl-2及Bax蛋白表达，在哇巴因作用后，对Bcl-2蛋白表达未检测到明显的变化，而Bax蛋白以浓度依赖性方式增加，这使Bcl-2/Bax比值下调，Bcl-2/Bax比值在一定程度上可反映细胞凋亡的趋势。本实验证实了哇巴因可能通过降低Bcl-2/Bax比值诱导细胞凋亡，而哇巴因使这些基因发生改变的途径尚需进一步研究。凋亡是由多种蛋白酶控制的事件，caspase家族属于半胱-天冬氨酸蛋白酶家族，是近年来发现的与细胞凋亡极为密切的一组蛋白酶。已有研究表明，该家族可能以链式激活 、循环放大、异源寡聚化三种方式参与凋亡的发生。Caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡执行者，广泛分布于各种类型的细胞中，caspase-3在细胞中以无活性的酶原形式存在，活化的caspase-3能促进凋亡信号的传导，特异地切割死亡底物多聚ADP核糖多聚酶（PARP），从而引起细胞凋亡的特征性改变［5］。报道，caspase途径参与了哇巴因诱导的人前列腺癌细胞系（PC-3）、平滑肌细胞、神经元细胞的凋亡过程［6-8］。我们在用哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡的过程中， caspase-3活性亚单位（p17）的出现表明无活性的caspase-3 酶原被激活，同时caspase-3活性显著增高，呈时间依赖性方式，与文献报道一致［6］，提示了caspase-3激活在这一过程中起着重要作用。线粒体释放细胞色素C是caspase-3活化的重要环节。目前的研究表明，Bcl-2家族主要是通过影响线粒体的功能，间接地影响caspase-3的激活，Bcl-2、BCL-XL能抑制线粒体膜通透性转运孔（mitochondrial permeability pore,MTP）的开放，维持跨膜电位，进而阻止线粒体内细胞色素C和凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor,AIF）的释放；Bax、Bak、Bid能诱导线粒体释放细胞色素C，从而激活caspase蛋白的级联反应，诱导凋亡的发生［9,10］。因此，我们推测哇巴因可能通过上调Bax蛋白的表达从而激活caspase-3最终使Jurkat细胞发生凋亡。
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