微小RNA及其在恶性淋巴增殖性疾病中作用的研究进展
【摘要】 在动植物基因组中广泛存在一类非编码蛋白的RNA 基因，产生长度大约为19-25 个核苷酸的RNA，它们被命名为微小RNA （microRNA，miRNA）。这是一类具有调节其他基因表达活性的小RNA。在生物的发育过程中发挥着重要作用。本文对这类基因的特征、生物学功能、产生与作用机制和在恶性淋巴增殖性疾病中作用的研究进展作一综述。
【关键词】 miRNA；非编码RNA；恶性淋巴增殖性疾病
Progress on the Research of MicroRNA and Its Functions in Lymphoid Malignancies——Review
Abstract Plant and animal genomes contain an abundance of small genes that produce RNAs of about 22 nucleotides in length，which was dubbed as microRNA （miRNA). These newly found endogenous RNAs may participate in a wide range of genetic regulatory pathways and play an important role in the organism development . This paper reviewed the recent studies and progress on the characteristics，functions and mechanisms of the microRNAs，as well as the advances of research on lymphoid malignancies.
Key words miRNA; non-coding RNA ; lymphoid malignancies
很多年来，DNA和蛋白质一直是基因组研究中的主角，而RNA只是被看作来往于DNA和蛋白质间的信使而已。最近，越来越多的证据已清楚地表明，RNA在几乎所有动植物物种中扮演的角色远比我们早先料想的活跃。真核生物中存在两种主要的非编码RNA（non-coding RNA），并发挥着重要的作用。一类为小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），另一为微小RNA（microRNA，miRNA）。miRNA是一种大小19-25 nt的单链小分子RNA，最早被确认的miRNA是在线虫中的lin-4 （1993年）［1］和let-7（2000年）［2，3］，它们参与调控线虫的发育时序（development timing），由于它们的长度很短而且作用时间短暂，所以lin-4 和let-7一开始被称为时间小RNA （small temporal RNA，stRNA）。后来随着大量的miRNA被发现，对这些小分子RNA 的基因序列、加工表达方式、生理功能等方面研究表明，miRNA发挥着非常重要的、基因表达的调节作用，从一个全新的角度来认识基因及其表达调节的本质。2002 年美国《》杂志评出的年度十大科技突破中，miRNA 的发现名列榜首。到目前为止已报道了在人类、果蝇、植物等多种生物物种中有将近1400个miRNA被报道。现在除了lin-4 和let-7 外，其他miRNA统一用miR-#（#代表数字）表示，而相应的编码基因则用mir-#（#代表数字）表示。本文就miRNA特征和功能的研究进展以及与恶性淋巴增殖性疾病的关系作一综述。
微小RNA的特征
miRNA广泛存在于真核生物中，与其他寡核苷酸相比，主要有以下特征。
（1）一般来源于染色体非编码蛋白区的一段，本身不具有开放读框 （ORF） 及蛋白质编码基因的特点，现已鉴定的miRNA没有一个与已知的表达序列标签（EST）匹配，说明它们是由不同于mRNA的特殊转录单元表达的［4］。
（2）成熟的miRNA长度一般为19-25 nt，是由具有发夹结构的约70-90 nt的单链RNA前体经过切酶（RNA）Dicer酶加工后生成［5］，它们可以和上游或下游的序列不完全配对形成茎环结构，这种茎环结构参与了成熟miRNA的加工。
（3）成熟的miRNA 5′ 端有一磷酸基团，3′ 端为羟基，定位于RNA前体的3′ 端或者5′ 端，且具有独特的序列特征。其5’端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第2-4个碱基缺乏U，一般来讲，除第4个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。
（4）miRNA基因不是随机排列的，其中有一些成簇存在。多个miRNA 基因共同转录成一个前体RNA，然后成熟的miRNA从这个前体上加工而来［6］。来自同一个基因簇中的miRNA具有较强的同源性，而不同基因簇中的miRNA同源性较弱。例如线虫中一组高度相关的miRNA基因——mir-35-mir-41，集中簇生在2号染色体的1 kb片段上，共同转录成1个前体miRNA，然后加工形成7个成熟的miRNA，在胚胎和成虫早期均高度表达，而在其他发育阶段不表达。
（5）多数miRNA 的基因结构和功能在进化中呈现保守性，各种miRNA都能在其他种系中找到同源体。约12%的miRNA在线虫、果蝇、哺乳动物和植物中呈现保守性，经序列比对发现，这些保守片段中的碱基差异仅为1-2 nt。其中miR-1、miR-34、miR-87在非脊椎动物和脊椎动物中高度保守。对miRNA的表达和进化保守性的解释是：为数众多的miRNA构成了调节性RNA家族，通过与mRNA内的特定靶序列互补配对，参与这些基因的表达调控［7］。
（6）miRNA的表达具有阶段特异性和组织特异性，即在生物发育的不同阶段里有不同的miRNA表达，在不同组织中表达不同类型的miRNA［8］。大多数miRNA的表达具有时序性，miR-3、miR-7基因只在果蝇胚胎形成时表达，而miR-1、miR-12的含量在果蝇幼虫阶段急剧上升，并在成虫期维持较高水平，同时在所有阶段都存在的miR-9和miR-11的含量却急剧减少［9］。小鼠胚胎中miR-1也呈阶段性表达，只在胚胎形成的阶段可以探测到其存在。miRNA的表达具有细胞和组织特异性，Bartel等［10］发现在已经鉴定的16个miRNA中，有15个只在特定的植物组织中高水平表达。miR-1在人类和成年鼠心肌组织中特异性表达，在其他组织中检测不到；miR-17、miR-20位于HeLa细胞同一基因簇内，并在斑马鱼细胞中表达，但在鼠肾和蛙卵巢细胞中未检测到；miR-1和let-7都在成年果蝇中表达，而不在20-24小时的胚胎细胞中表达，在HeLa细胞中却只测到let-7 miRNA。在不同的细胞和组织中不同的发育时间中差异表达，显示了它们在控制个体发育中的特定功能。
微小RNA的功能
目前只有极少的miRNA功能被初步阐明，绝大部分miRNA的功能（特别是在哺乳动物中）还不清楚。miRNA在生物的整个发育过程中可能有以下重要的功能。
个体发育的调控
在线虫的发育过程中lin-4和let-7呈生长阶段的特异性表达，通过对mRNA序列特异的反义抑制，对线虫幼虫不同发育阶段的过渡进行调控。lin-4控制幼体早期发育阶段（幼虫1期到幼虫2期）的细胞分化，而let-7控制幼虫4期以后的阶段到成体的转换，诱导发育进展。Gary等［11］曾报道缺乏或过度表达lin-4和let-7都会引起异时表型（异时是指祖先和后代种类在发育事件相应时间上互不相同的情况），即改变了发育过程中速度调控的过程。在植物miRNA的研究中，发现植物心皮工厂（carpel factory，car）突变株中3个miRNA的表达水平显著下降。植物心皮工厂是一个类似切酶的酶，参与植物的发育，其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示，这种缺陷是由于缺少miRNA加工而造成的［10］。
参与细胞分化和组织发育
lin-4、let-7、mir-14、mir-23和矮脚鸡（bantam)基因已被证实在细胞分化和组织发育中起重要作用［12］。Chen等［13］首次阐述了哺乳动物中miRNA的功能，利用逆转录病毒作载体使miR-181在鼠科动物的造血祖细胞中异常地表达，然后用不同的条件处理这些细胞，分析B淋巴细胞和T淋巴细胞，发现B淋巴细胞量加倍，而T淋巴细胞不受影响。这暗示miRNA可能在鼠类和人的细胞发育分化中起着关键的作用。双侧不对称性（bilateral asymmetry）是很多生物神经系统发育过程中的正常现象，然而对这种机制现在了解得还很少。Johnston等［14］发现，在线虫神经细胞中有一种miRNA（此种miRNA的基因被称为lsy-6）控制着左/右神经细胞的不对称基因表达（cog-1是1sy-6 miRNA 靶基因），这可部分解释神经系统功能的非对称性。
调控基因的表达
人类基因中有超过20%的基因是由被miRNA所调节的［15］，一些miRNA通过调节下调靶mRNA的表达［16］。对lin-4和let-7的研究表明，miRNA的主要功能是进行转录后调控（posttranscriptional regulation）。
miRNA可以通过两种机制中的一种调节靶基因的表达，其中之一是结合到靶mRNA 3′ UTR，抑制其翻译；二是像siRNA作用一样结合到靶上并降解靶mRNA［17］。miRNA可以作为触发RNA干扰（RNAi）的分子［18］参与细胞增殖［19］、死亡［20］、细胞凋亡［21］和脂肪代谢［22］。miRNA还可能与转座的抑制、基因重组有关，可能参与转录和转录后水平的基因表达调控，因此，认为miRNA可能和高等真核生物中调节基因表达的转录因子一样重要。
miRNA 的加工机制和作用机制
加工机制
据体内外实验研究表明，miRNA的生成至少需要两个步骤：第一步在细胞核内，将长的内源性转录本（pri-miRNA）加工为70-90 nt的茎环的二级结构的前miRNA（pre-miRNA），执行此过程的酶是RNase Ⅲ家族中一员——Drosha，其作为核心核酸酶执行核内miRNA前体加工的起始［23，24］；第二步在细胞质中，将茎环的二级结构前体加工为成熟的miRNA，执行此过程的酶为RNase Ⅲ超家族中另一员——切酶（dicer），后者是一种ATP 依赖的核酸内切酶。亚细胞定位研究证明，这两个生物过程分别局限于细胞核和细胞质内，因此细胞中一定还存在一转运体系，将pre-miRNA从细胞核运送至细胞质。由此可见，miRNA的表达可从上述三个方面进行调控［25］。
Pre-miRNA在被dicer/argonaute 复合物特异性识别，并剪切成22 nt左右的单链小RNA，miRNA是pre-miRNA茎中的一个臂。Dicer可以剪切pre-miRNA 5′ 端的一个臂，也可以剪切3′ 端的一个臂或者是同时剪切两个臂［7］。Dicer及其同源物DCR-1是一类多结构域的RNase III样蛋白，对双链RNA或茎环结构RNA进行剪切，产生长度约为22 nt、5′ 末端为单磷酸基、3′ 末端为羟基的RNA产物［26］。
作用机制
Ambros［17］研究发现lin-4和let-7与靶mRNA的3′ UTR部分互补结合，从而抑制了蛋白质的合成。在植物中研究发现miRNA和靶mRNA完全互补最终导致了靶mRNA的降解［12］。而在动物中miRNA与靶mRNA通过不严格的碱基配对，抑制了mRNA的翻译［27］，而此时并不诱导mRNA的降解。然而，有时情况并非完全如此：在动物中，这种碱基是否严格配对将决定基因沉默方式，如果miRNA和靶mRNA完全互补它就能进入RNAi途径并且引导靶mRNA降解而不是抑制翻译［28］。在拟南芥（arabidopsis）中即使miR-JAW和其靶序列不完全配对，它也能够通过降解mRNA来调控转录因子TCP家族的五个成员［29］，其具体机理目前还不清楚。
miRNA与siRNA的联系和区别
从miRNA很容易联想到另外一种外源性的RNA小分子——小干扰RNA（siRNA）。miRNA与siRNA之间存在许多相同之处：①在加工方面，siRNA与miRNA从双链前体加工到成熟的22 nt左右的小分子RNA，都是dicer产物，因此具有dicer产物的特点；②在功能效应方面，二者的生成都需argonaute家族蛋白的存在，同是RISC（RNA interference specificity complex，RISC）的组分，因此在siRNA和miRNA介导的沉默机制上有重叠。
但miRNA在以下几个方面与siRNA不同：①miRNA是细胞内RNA的固有组分之一，而siRNA是在RNAi生成过程中形成的中间体，也即siRNA是在病毒感染或人工插入dsRNA后诱导而成的；②dicer酶对两类RNA的加工过程不同，miRNA为不对称加工，仅来自含茎-环结构RNA前体的一侧臂，剩余部分很快降解，而siRNA是对称来源于双链RNA的前体的两侧臂；③成熟的miRNA是以单链形式存在的，而成熟的siRNA是双链形式存在。虽然推测miRNA具有双链RNA前体，但是在Northern印迹实验中未检测到双链RNA前体，可能是因为前体存在的时间非常短暂；④siRNA与靶mRNA完全互补配对结合，引导核糖核酸酶复合体RISC的形成，使它能精确特异地在siRNA互补区域里剪切，导致目标mRNA降解。miRNA与靶RNA并不完全互补，存在错配现象，引起翻译抑制，或者其他一些遗传调节，并不导致目标RNA的降解。siRNA的靶序列有一个核苷酸突变，就会影响到RNAi的沉默效应，而miRNA是不能完全识别的，也不会影响到miRNA途径的调节效应；⑤miRNA在转录后水平和翻译水平起作用，而siRNA为转录后水平调控，siRNA介导靶mRNA的位点特异性裂解，而已知的miRNA介导3′ UTR互补的转录后翻译抑制。
随着研究的深入，这种区别变得模糊不清。例如，在线虫中，siRNA像miRNA一样，有可能是单链的［30］。另外，在线虫和HeLa细胞中，let-7基因的miRNA起着和siRNA相似的作用，也出现在RISC蛋白复合体中。当它遇到完全配对的目标RNA时，可导致目标RNA剪切［28］。研究认为，如果与目标RNA存在完全配对，RISC蛋白复合体介导RNA剪切，如果是不完全配对，则是翻译抑制，机制的选择可能主要或完全依赖于与靶RNA的互补程度［31，32］。
MicroRNA与恶性淋巴增殖性疾病
miRNA在恶性疾病中的作用引起很大的关注，认为miRNA在肿瘤发病中起重要作用［33］。Calin等［34］研究发现50%以上的miRNA基因定位于与肿瘤相关的区域或脆性区域。最近耶鲁大学癌症中心的Johnson等［35］研究发现，一个与肺癌有关的染色体区域上的let-7是癌基因Ras表达的一种调节因子。Let-7通过与Ras基因结合来调节Ras，并抑制Ras蛋白的翻译，在肺癌组织中，let-7表达低于其他正常肺组织，而Ras蛋白则明显增加。
在恶性淋巴增殖性疾病中，miRNA直接参与染色体的缺失，大约50%的慢性淋巴细胞白血病（CLL）中有染色体13q14的缺失，miR-15和miR-16基因定位于染色体的13q14位置上，在CLL病人中发现这两个基因的表达有缺失或下调现象存在［36］。近来Eis等［37］研究发现在一些B细胞淋巴瘤，包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中miR-155的拷贝数较正常循环中B细胞高10-30倍。活化B细胞型DLBCL的miR-155拷贝数明显高于生发中心型DLBCL，且前者具有较差的预后，可以认为miR-155的表达量可以作为B细胞淋巴瘤的诊断和预后指标。我们运用Northern印迹的方法在G519、HRC57、RCK8、BEVA、OCL-LY8和MD901的6个B细胞淋巴瘤细胞系中均检测到miR-28的表达，未发现表达差异。Calin等［38］运用基因芯片技术对CLL样本中数百个miRNA前体和miRNA进行检测，根据结果将CLL分为两组，且与CLL疾病状态和ZAP-70的表达有关，认为miRNA的表达与此类白血病的生物学和临床行为密切相关。
展望与前景
近年来大量的miRNA被发现，使得人们对RNA的功能有了一个全新的认识，同时也为人们提供了一种全新的角度来认识生物基因和基因表达调节的本质。
尽管在以miRNA为代表的非编码RNA研究方面已经取得了突破性的进展，已经有大量的非编码RNA被发现，它们的功能也是非常多样和重要，但是，毫无疑问细胞中还有大量的非编码RNA未被我们发现，肯定还有许多非编码RNA形式的功能有待我们去探索。当前人类基因组计划已经基本完成，全面研究不同细胞在不同时期的所有非编码RNA的种类和功能成为后基因组时代的必需和必然。随着研究的深入，miRNA将在生命起源、早期进化、基因复杂性和疾病原理等方面产生更为重要的影响。
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