人端粒重复序列结合因子(hTRF1)蛋白质在急性白血病中的表达水平与端粒酶活性关系的研究
作者：施继敏，黄河，陈巧芳，林茂芳
【摘要】 为了研究人端粒重复序列结合因子（TRF1）蛋白质在急性白血病（AL）及正常骨髓组织中的表达水平，AL和正常骨髓组织中端粒酶活性及TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性的关系， 定量分析了AL患者及正常人骨髓组织中TRF1蛋白质的表达水平，并应用经倍比稀释的TRF133-277纯化蛋白质作为定量标准，建立以抗TRF133-277单克隆抗体的定量Western blot的方法，而且以该方法检测TRF1蛋白质在组织中的表达水平；另外，应用TRAP-PCR-ELISA法检测AL患者及正常人骨髓组织端粒酶活性，以研究 TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性的关系。结果 表明： 20例AL患者骨髓组织中TRF1表达水平较正常人骨髓组织显著降低，差异具有显著性(P<0.01)；急性淋巴细胞性白血病患者的TRF1表达水平较急性非淋巴细胞性白血病患者略减低，但差异无统计学意义(P>0.05)；化疗缓解的患者TRF1表达水平较前增高，但仍低于正常（P<0.01）；化疗后完全缓解患者的TRF1表达水平较未缓解的患者显著增高，差异具有显著性(P<0.01)；AL患者初发未治时骨髓细胞端粒酶的活性明显高于正常人（P<0.05）和首次缓解者（P<0.01）；初发未治时，ALL患者骨髓细胞端粒酶活性略高于ANLL患者，但差异无统计学意义(P>0.05)。TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性呈明显负相关（P<0.001）。结论： TRF1蛋白质在AL患者骨髓细胞中的表达明显减低，且与疗效及端粒酶活性相关。
【关键词】 急性白血病； 人端粒重复序列结合因子； 蛋白质表达水平； 端粒酶活性
Expression Level of TRF1 Protein in Human Acute Leukemia and Its Relationship with Activity of Telomerase
AbstractThe study was aimed to investigate the expression level of TRF1 protein in human acute leukemia and relationship between expression level of TRF1 protein and activity of telomerase. A quantitative Western blot technique was developed using anti-TRF133-277 monoclonal antibody and GST-TRF1 fusion protein as a standard to further determine the expression level of TRF1 protein in total proteins extracted from clinical specimens. 20 cases of acute leukemias were studied when 11 normal volunteer's bone marrow was used as control. The results showed that the expression level of TRF1 protein in normal bone marrow (2.217±0.461 μg/μl) was significantly higher than that in bone marrow of acute leukemia patients (0?754±0.343 μg/μl) (P<0.01). There was no remarkable difference of expression level of TRF1 protein between ALL and ANLL (0.628±0.281 μg/μl vs 0.844±0.360 μg/μl, P>0.05). After chemotherapy, TRF1 expression level of patients with complete remeision raised (0.772±0.307 μg/μl vs 1.683±0.344 μg/μl, P<0.01), but lower than that of normal (2.217±0.461 μg/μl , P<0.01). TRF1 expression level of patients without complete remission was not remarkable different after chemotherapy (0.726±0.443 μg/μl vs 0.894±0.338 μg/μl, P>0.05). TRF1 expression level of patients with complete remession was higher than that in patients without complete remession (1.683±0.344 μg/μl vs 0.894±0.338 μg/μl, P<0.01). For all sample the telomerase activity was determined. It was confirmed that the activity of telomerase in normal bone marrow was lower than that in bone marrow of acute leukemia patients (0?125±0.078 μg/μl vs 0.765±0.284 μg/μl, P<0.01). There was no significatly difference of expression level of TRF1 protein between ALL and ANLL (0.897±0.290μg/μl vs 0.677±0.268μg/μl, P> 0.05). After chemotherapy, telomerase activity of patients with complete remeision reduced (0.393±0?125 μg/μl), but higher than that of normal (0.125±0.078 μg/μl, P<0.01). It is concluded that expression level of TRF1 protein in AL patients is signiticantly decrese and associated with therapeutic efficaciousness and the activity of telomerase (P<0.001).
Key wordsacute leukemia; hTRF1; protein expression level; telomerose activity
端粒、端粒酶及端粒调节系统在细胞衰老、肿瘤发生中起重要作用。研究表明，有超过85%的恶性肿瘤的端粒酶活性高于正常组织,且增高的程度可能与疾病预后有关。 TRF1的作用以及与恶性肿瘤的关系至今缺乏蛋白水平定量分析。本研究以抗TRF133-277单克隆抗体对急性白血病细胞中TRF1表达水平作定量Western blot检测，同时对急性白血病细胞进行端粒酶活性检测，分析TRF1蛋白质在正常和AL骨髓组织中的表达状况以及端粒酶活性与TRF1表达之间的关系，以便进一步在蛋白水平研究TRF1在AL发生、中的作用。
材料和方法
组织标本
标本取自2002年5月至2002年8月浙江大学医学院附属第一初发未治的20例AL患者骨髓，同一病例在初发时和首次化疗后分别抽取骨髓进行自身对照研究。20例AL患者均按国内诊断标准［1］确诊，其中男性10例，女性10例，年龄12-70岁，中位年龄39.1岁。20例AL患者中急性淋巴细胞性白血病（ALL）8例，包括ALL-L1 2例，ALL-L2 3例，ALL-L3 3例；急性非淋巴细胞性白血病12例，包括M2 7例（M2a 5例，M2b 2例），M3a 1例，M4b 1例，M5b 3例。正常骨髓捐赠者11例作为对照。
试剂及抗体
丙烯酰胺、N-N亚甲双丙烯酰胺和TEMED均购自上海生物工程公司。羊抗鼠IgG/HRP、兔抗羊IgG/HRP购自北京中山试剂公司。TRF133-277纯化蛋白、抗TRF133-277单克隆抗体均由本研究组提供［2］。增强化学发光试剂（enhanced chemiluminesence, ECL）购于华美生物试剂公司。端粒酶PCR-ELISA试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。阳性对照为人胚肾293细胞株（试剂盒提供），阴性对照为端粒酶提取物加1 μg/μl RNase A，37℃孵育20分钟。
标本留取
对初发未治患者在初诊时、第1次化疗后各取骨髓2-3 ml，ACD抗凝。加入与标本等量的淋巴细胞分离液（Ficoll）于玻璃离心管中。轻轻加入以PBS稀释的标本（外周血或骨髓）。600-750×g离心10-15分钟。吸取中间单个核细胞层移入Eppendoff管或玻璃离心管中。用PBS洗2次， 450×g离心约10分钟。计数，按每管1×107或1×106分装于Eppendoff管，甩干后，-80℃冻存。
TRF1蛋白质表达水平的定量Western blot检测
细胞蛋白质提取每份单个核细胞以5倍体积的预冷蛋白质提取液重悬，剧烈振动混匀。100℃煮沸10分钟，12 000×g离心30分钟取上清。以小牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白定量标准，紫外吸收法测蛋白质含量，-70℃冻存。
定量Western blot检测参照Luo等［3］的方法进行定量Western blot检测：取约20 μg的样本总蛋白质经10% SDS-PAGE电泳（200 V）分离、电转移至硝酸纤维素膜（100 V，1小时），以含7%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭后，与抗TRF133-277单克隆抗体室温反应20分钟，4℃过夜，洗膜，羊抗鼠IgG/HRP中反应1小时，TBST洗膜2小时。ECL温浴1分钟，X光胶片感光20至60秒，经显影定影显现信号。信号条带以Ultroscan XL(Pharmacia LKB)激光光密度仪扫描，根据条带的面积和深浅密度积分。以倍比稀释的纯化TRF1蛋白质为定量标准，其浓度依次为0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0及4.0 μg/μl。每次实验同时设一组定量标准作标准曲线,并以此计算组织样本中TRF1的相对含量。
AL端粒酶活性检测
参照端粒酶PCR-ELISA试剂盒（Boehringer Mannheim公司）提供的方法，进行端粒酶提取以及端粒酶活性测定。
统计学处理
采用SPSS 11.0统计软件包进行统计检验。同一样本配对用配对t检验；方差齐，用方差分析，用SNK（即Q检验）两两比较；方差不齐，用秩和检验，用bonferroni两两比较；相关性分析用Pearson相关分析。
结果
定量Western blot标准曲线的建立
以经倍比稀释的TRF133-277纯化蛋白质作为相对定量标准。根据各稀释度纯化蛋白质的每个Western blot条带密度积分值与其相应的含量作图，建立标准曲线。以此标准曲线将组织样本中TRF1蛋白质的Western blot条带密度积分值转化为组织样本中TRF1蛋白质的相对含量。图1为倍比稀释的TRF133-277纯化蛋白质（0.0625 μg/μl -4.0 μg/μl）与抗TRF133-277单克隆抗体作Western blot的结果、以及由此结果数据化后建立的标准曲线。
AL患者及正常骨髓组织TRF1蛋白质表达的Western blot定量分析
20例AL患者样本均不同程度的表达TRF1蛋白质，均值为0.754±0.343 μg/μl, 正常骨髓组织TRF1的表达水平为2.217±0.461 μg/μl。初发急性白血病TRF1表达水平明显低于正常骨髓组织，且差异具有显著性（P<0.01）（表1）。图1为其中一组实验结果。Table 1. Expression level of TRF1 protein and telomerase activity in acute leukemia（略）
TRF1蛋白质表达与AL分类的关系
20例AL中8例为急性淋巴细胞性白血病（ALL），12例为急性非淋巴细胞性白血病（ANLL），化疗前TRF1的表达水平分别为0.618±0.284 μg/μl，0.844±0?360 μg/μl， 经Q检验，两种类型白血病之间TRF1的蛋白质表达水平无显著性差异（P>0?05）(表2）。Table 2. Expression level of TRF1 protein and telomerase activity in ALL,ANLL（略）
TRF1蛋白质表达与疗效关系
20例AL中有12例首次化疗后达完全缓解，8例首次化疗后未缓解。缓解患者的TRF1表达水平与前相比明显增高，分别为1.683±0.344 μg/μl 和0.772±0.307 μg/μl（P<0.01），但仍低于正常骨髓组织（2.217±0.461 μg/μl ，P<0.01），未缓解与治疗前相比表达量无明显变化（0.894±0.338 μg/μl vs 0.726±0.413 μg/μl ，P>0.05）（表3、4）。Table 3. Expression level of TRF1 protein in AL patients with complete remission（略）Table 4. Expression level of TRF1 protein in AL patients with non-complete remission（略）
AL端粒酶活测定
AL患者化疗前骨髓细胞端粒酶活性为0.765±0?284，明显高于正常人0.125±0.078（P<0.05）,也明显高于完全缓解者0.393±0.125（P<0.01）(表1）。化疗前，ALL患者骨髓细胞端粒酶活性（0?897±0.290）高于ANLL患者（0.677±0.268），但无统计学差异（P>0.05）（表2）。
TRF1蛋白质表达与端粒酶活性的关系
对11例正常骨髓组织及20例AL患者初发、治疗后的TRF1蛋白质表达水平与端粒酶活性相关性分析结果显示，正常骨髓组织（r=-0.891, P<0?001）、AL患者初发（r=-0.881, P<0.001）、治疗后（r=0.820, P<0.001）TRF1蛋白质表达水平均与端粒酶活性明显负相关。
讨论
近年来的研究证实，TRF1作为一种端粒酶活性调节因子参与了端粒酶活性调节。它可以特异地结合于端粒TTAGGG重复片段，通过对端粒长度的调节抑制端粒酶活性，因此被认为是一种端粒负性调节因子 ［4］。Yamada等［5］报道，在AL中TRF1 mRNA的表达明显低于正常细胞，Aragona等［6］应用抗TRF1多克隆抗体对颅脑肿瘤进行免疫组织化学染色，结果发现TRF1在恶性肿瘤中的表达明显低于正常组织、炎症及良性肿瘤。本研究以系列稀释的TRF纯化蛋白作为相对定量标准，建立了以抗TRF133-277单克隆抗体作定量Western blot的方法。实验中对TRF1纯化蛋白和组织样本以同样的方法定量，并同时以相同的条件作SDS-PAGE和免疫印迹，排除了其他因素对结果的影响。实验中的定量标准曲线经统计均分析符合线性关系，通过此标准曲线将组织样本的密度积分值转化为蛋白含量的相对值，样本之间的TRF1蛋白表达水平有直接的可比性。实验中在每次实验时均设一组定量标准作标准曲线，减少了组间误差，使结果更可靠，可比性更强。 本研究结果发现： ①AL及正常骨髓组织不同程度表达TRF1蛋白质，AL比正常骨髓组织中TRF1表达水平明显降低（P<0.001），此结果符合TRF1作为端粒酶负调控因子在肿瘤组织中低表达的理论假说，也与国外学者关于TRF1在颅脑肿瘤中低表达的报道结果类似；②化疗后完全缓解患者与治疗前相比TRF1表达量明显增高，（P<0.001），但仍低于正常骨髓组织（P<0.001），未缓解患者与治疗前相比TRF1表达量无明显变化（P>0.05）。这一结果提示TRF1蛋白质的表达水平与临床疗效有关，它有可能作为一种动态检测观察白血病的疗效和病情变化的指标；③两种类型白血病之间TRF1的蛋白质表达水平无显著性差异（P>0.05）。Ohyashiki等［7］报道，ALL患者的TRF1mRNA的表达较ANLL患者增高，本研究的结果提示在TRF1 mRNA的表达和蛋白质表达之间可能存在不一致性。我们对20例AL患者和11例正常人骨髓细胞进行了端粒酶活性检测，结果发现所有初发未治的AL细胞端粒酶活性均高于正常骨髓细胞，治疗缓解后白血病细胞端粒酶活性随之降低，但仍高于正常骨髓细胞。ALL端粒酶活性与ANLL相比有差异，但无统计学意义。这提示端粒酶的激活与AL的发生、密切相关，临床上可通过端粒酶的动态检测观察白血病的疗效和病情变化，但无法区分ALL和ANLL。本研究进一步对11例正常骨髓组织及20例AL患者初发、治疗后的TRF1表达水平与端粒酶活性的关系进行了研究。结果显示，TRF1蛋白质的表达水平与端粒酶活性呈负相关（P<0.001）。此结果表明TRF1虽然直接参与端粒长度的调节，但其也可能通过对端粒酶活性的调控影响细胞的生物学行为而在肿瘤的发生、发展中起重要作用。 迄今为止，国外有关TRF1蛋白质表达水平与恶性肿瘤关系仅见Aragona等［6］在颅脑肿瘤中的研究报道，并且是用抗TRF1多抗进行的免疫组织化学研究。本研究以倍比稀释的纯化GST-TRF1蛋白质的Western blot条带密度积分值与蛋白质含量之间的标准曲线，作为组织样本中TRF1蛋白的定量标准，以期直接对TRF1蛋白质本身在组织中的表达水平作出定量测定。我们应用抗TRF133-277单克隆抗体及定量Western blot方法对AL患者及正常骨髓组织中TRF1的蛋白质表达水平进行了检测，显示了该法具有更敏感、直接和可靠的优点。对AL患者中TRF1表达的定量测定以及其与端粒酶关系的研究，为进一步深入探讨TRF1在肿瘤发生、发展中的作用机制提供实验依据。
【】
1 张之南，沈悌，主编. 血液病诊断及疗效标准. 第2版， 北京：出版社，1998：171-183
2 黄河，施继敏，陈巧芳等. 抗人端粒重复序列结合因子（TRF133-277）单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定. 中华血液学杂志,2002; 23:631-633
3 Luo J,Bosy TZ, Wang Y, et al. Ontogeny of NMDA R1 subunit protein expression in five regions of rat brain. Brain Res Dev Brain Res, 1996;92:10-17
4 van-Steensel B, de-Large T. Control of telomere length by the human telomeric protein TRF1. Nature, 1997;385（6818）:740-743
5 Yamada K, Yajima T, Yagihashi A, et al. Role of human telomerase reverse transcriptase and telomeric-repeat binding factor proteins 1 and 2 in human hematopoietic cells. Jpn J Cancer Res, 2000; 91: 1278-1284
6 Aragona M, De-Divitiis O, La-Torre D, et al. Immunohistochemical TRF1 expression in human primary intracranial tumors. Anticancer Res, 2001;21: 2135-2139
7 Ohyashiki JH, Hayashi S, Yahata N, et al. Impaired telomere regulation mechanism by TRF1 (telomere-binding protein), but not TRF2 expression, in acute leukemia cells. Int J Oncol, 2001;18: 593-598
