人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究
作者：马俐君，高磊，周虹，邱慧颖，胡晓霞，解琳娜，王健民
【摘要】 为了研究人骨髓间充质干细胞（MSC）作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用，将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系（HFCL）经60Co γ线照射后分别制备细胞滋养层，比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC- IC数的影响。结果表明， 无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO)， HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组，以第0天细胞数为100%（下同），有细胞因子组为(9797±361）% vs (7061±418）%，无细胞因子组为(5305±354)% vs (1992±247)%，均P<0.01。 MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异［（825±305）% vs (820±191)%，P>0.05］，但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组［（939±212）% vs (1617±222)%，P<0.01］。MSC滋养层组维持脐血中LTC- IC的能力明显优于HFCL滋养层组［第5周CFU- GM数（129.95±8.73）个/105接种细胞数 vs （89.81±10.29）个/105接种细胞数，P<0.05］；细胞因子存在时，其作用更为明显［第5周CFU- GM数（192.93±4.95）个/105接种细胞数 vs （90.47±14.28）个/105接种细胞数，P<0.01］。MSC与HFCL按一定比例混合，可提高扩增效率。当MSC与HFCL之比为4∶1时，集落形成数量最高，达（186.89±11.11）个/105接种细胞数，明显高于比例为3∶2（131.45±13.02）个/105接种细胞数和二者单用组［前者（138.92±14.84）个/105接种细胞数，后者（64.63±6.11）个/105接种细胞数；均P<0.01］。结论: MSC维持脐血中LTC- IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL，HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC，MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率。
【关键词】 间充质干细胞；脐血CD34＋细胞；CD34+细胞扩增
Effects of Human Mesenchymal Stem Cells and Fibroblastoid Cell Line as Feeder Layers on Expansion of Umbilical Cord Blood CD34+ Cells In Vitro
AbstractTo investigate the effects of human mesenchymal stem cells (MSC) and human fibroblastoid cell line (HFCL) as feeder layer on expansion of umbilical cord blood CD34+ cells in vitro, 60Co γ-ray irradiated MSC and HFCL were used as feeder layer to expand cord blood CD34+ cells in culture. The efficiencies of MSC and HFCL on expansion of CD34+ cells in culture with or without cytokines were compared. The results showed that no matter whether cytokines （rhFL,rhSCF,rhTPO) were added, the proliferation of nucleated cells after expansion for 12 days in HFCL group was statistically higher than that in MSC group, i.e. with cytokines (9797±361)% vs (7061±418)%; without cytokines (5305±354)% vs (1992±247)%, when the cell numbers at day 0 was accounted as 100%), P<0.01. The proliferation of propagated CD34+ cells between MSC group and HFCL without addition of cytokines was not statistically different (820±191)% vs (825±305)%, P＞0.05. However, in the presence of cytokines, the propagating rate of MSC group was lower than that of HFCL group (939±212)% vs (1617±222)%, P＜0.01. MSC was better than HFCL in maintaining the LTC- IC of UCB CD34+ cells, i.e. the number of CFU- GM colonies in the fifth week was (129.95±8.73) /105 seeded cells vs (89.81±10.29) colonies/105 cells , P＜0.05; with addition of cytokines, the effect was more obvious, i.e. the number of CFU- GM colonies in the fifth week（192.93±4.95）/105 seeded cells vs （90.47±14.28） colonies/105 seeded cells, P＜0.01. MSC mixed with a certain proportion of HFCL facilitated maintaining the LTC- IC of UCB CD34+ cells. When the proportion was 4∶1, the number of CFU- GM colonies was the highest（186.89±11.11）/105 seeded cells, which was higher than that of both 3∶2 group ［（138.92±14.84）colonies/105 seeded cells］ and MSC only group, i.e.（64.63±6.11） colonies/105 seeded cells, both P<0.01. It is concluded that HFCL is better than MSC in maintaining the expansion of CD34+ cells and cytokines can enhance this effect， while MSC are stronger than HFCL in maintaining the LTC- IC of UCB CD34+ cells in vitro. MSC with addition of a certain proportion of HFCL can significantly enhance the efficiency of CD34+ cell expansion.
Key wordsmesenchymal stem cell； cord blood CD34+ cell； CD34+ cell expansion
体内的稳态造血依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境，人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）是成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞等多种骨髓造血微环境的重要组成细胞的前体细胞，在造血调控中起着关键的作用。有实验和临床研究证实，MSC与造血干/祖细胞（HSPC）共移植可促进移植后造血重建，然而具体机理目前尚无定论。明确MSC体外支持造血的作用对于进一步研究MSC在造血干细胞移植中的作用及提高MSC的效率具有重要意义。为此我们进行了从体外到动物体内的系列研究。本研究报道在建立了成人骨髓MSC的大规模分离培养方法的基础上，通过比较MSC与早前建立的有明确体外支持造血作用的骨髓成纤维细胞样基质细胞系(human fibroblastoid cell line, HFCL)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的差异，明确MSC体外支持造血细胞增殖的能力，为进一步开展体内支持造血的研究提供实验依据。
材料和方法
细胞培养
胎儿来源的成纤维细胞样人骨髓基质细胞系HFCL由医学院血液学研究所姜学英建系，本室保存［1］。人骨髓间充质干细胞为复苏后的P3代冻存细胞（采集健康志愿者骨髓液，分离MSC并体外培养，流式细胞术检测各代细胞表面标志为CD34、CD45、CD14，CD80(B7- 1)、CD86(B7- 2)、CD40、CD40L(CD154) 和 HLA- DR阴性，CD29、CD44、CD90、CD105和CD166阳性，体外能够诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞，详细数据另文发表）。MSC培养基为含10% FBS为主的低糖DMEM。CD34+细胞培养体系为IMDM中含15% HS、15% FBS、5×10-5mol/L氢化可的松、4 mmol/L L-谷氨酰胺。长期培养起始细胞（long-term culture-initiating cells， LTC-IC）培养体系MyeloCult H5100和CFU- GM甲基纤维素培养基为加拿大Stem Cell Tech产品。重组人Flt- 3配体（rhFL)、重组人干细胞因子（rhSCF）、重组人血小板生长因子（rhTPO）等均为Sigma公司产品。
脐血CD34+细胞的分离纯化
脐血样品采用肝素抗凝，用淋巴细胞分离液（1?077 g/ml, 购自中国医学科学院血液病研究所）获得脐血单个核细胞悬液后进行CD34+细胞纯化（MACS磁性分离试剂盒，购自Miltenyi Biotec公司，Germany）。纯化后的细胞悬液取样计数，以PE标记的鼠抗人CD34单克隆抗体（购自Becton Dickinson公司，USA）标记细胞，流式细胞术测定CD34+细胞纯度。
MSC与HFCL支持脐血CD34+细胞增殖作用的比较
制备细胞滋养层将体外培养扩增的P3代MSC和基质细胞系HFCL按（1-5）×105个/孔的浓度接种于24孔、12孔或6孔培养板上，细胞呈单层完全贴壁后， 60Co γ线照射（1 500 cGy，20 cGy/min），照射后原条件培养24小时后弃培养液，换用相应培养体系进行后续实验。
实验分组根据滋养层细胞不同和是否添加细胞因子将实验分为6组： ①对照组： 无细胞因子无滋养层；②C组： 单加细胞因子；③H组： 骨髓基质细胞系HFCL；④H+C组： HFCL+细胞因子；⑤MSC组： MSC；⑥MSC+C组： MSC+细胞因子。细胞因子为： 50 ng/ml rhFL、50 ng/ml rhSCF和20 ng/ml rhTPO。
支持脐血CD34+细胞扩增的作用滋养层每组设3个复孔，共18孔。每孔接种前述脐血CD34+细胞悬液1 ml（1×104/ml）培养，隔日半量换液1次。12天后分别收集各孔全部悬浮及贴壁细胞（0.05%胰酶消化）， 300×g室温离心5分钟后以MSC培养液重悬，分别转移至新的6孔板中，静止培养3小时，收集悬浮细胞，离心后PBS重悬，取样计数活细胞，并用流式细胞术检测CD34+细胞数。
CD34+细胞增殖率（PR）=(扩增后细胞总数×扩增后CD34+细胞比例/接种细胞数×96.36%)×100％
滋养细胞体外维持LTC- IC的作用［2］将CD34+细胞按5×104/孔的浓度接种于制备好的含或不含细胞滋养层的12孔板中（同实验分组），置于LTC- IC培养体系、5％ CO2、33℃、饱和湿度下连续培养6－8周，每周半量换液1次，每次细胞取出后，按相同细胞数加入CFU- GM集落培养液，分别进行2周的集落培养，光学显微镜下按计数细胞数≥40的无色细胞团即为CFU- GM集落数，计数CFU- GM集落数。
不同比例MSC和HFCL维持LTC- IC的作用将MSC与HFCL按不同比例混合接种6孔板制备滋养层，细胞总数为5×105/孔（表1），同前照射后接种CD34+细胞（4×104/孔）。每组3个复孔，置于LTC- IC培养体系中，于5％ CO2、33℃、饱和湿度下连续培养5周，每周半量换液1次。第5周后收获所有细胞，同前方法加入CFU- GM集落培养基，培养2周后计数CFU- GM集落数。Table 1. Proportion and cell numbers of MSC and HFCL in maintaining LTC- IC culture system（略）
统计学处理
应用SPSS 医用统计软件包，采用卡方检验，配对样本t检验和单因素方差分析，进行数据统计学处理。P<0.05为差异显著，P<0.01差异非常显著。
结果
免疫磁珠分离纯化可获得高纯度的CD34+造血干/祖细胞
经FACS检测，MACS磁性分离试剂盒分离的脐血CD34+细胞纯度为96.36％。经尾静脉输注给NOD/SCID小鼠，能够重建人类淋巴和髓系的造血细胞（相关资料另文发表）。
在细胞因子的协同作用下，基质细胞系HFCL支持人脐血CD34+干/祖细胞增殖的作用明显强于MSC
人脐血CD34+细胞在不同滋养层和液体培养体系下进行体外培养12天后，细胞总数和CD34+细胞数的增长情况见图1。人脐血CD34+细胞在HFCL滋养层＋细胞因子组的扩增数量最高，细胞总数增加至接种细胞数（下同）的（9797±361）%，高于MSC滋养层＋细胞因子组的（7061±418）%及其它各组（P<0.01）(图1a)；CD34+细胞增加至（1617±222）%，也明显高于MSC滋养层＋细胞因子组的（939±212）%及其它各组（均P<0.01）(图1b)。单纯HFCL滋养层组细胞总数扩增至（5305±354）%，明显高于单纯MSC滋养层组的(1992±247)%和细胞因子组的（2383±347）%。单纯HFCL滋养层组CD34+细胞扩增至（825±305）%，和MSC滋养层组（82±191）%相比无显著统计学差异，但明显高于单用细胞因子组（444±61）%。
MSC维持脐血中LTC- IC的能力优于基质细胞系HFCL，有细胞因子协同时更为明显
比较加或不加细胞因子的情况下不同滋养层的长期培养体系中每周的GM- CFU集落形成数，明确MSC是否具有维持LTC- IC的作用。结果发现，有细胞滋养层组，无论是否添加细胞因子，在第1-8周均可见集落形成，但除第1周外，每个时间点，含MSC滋养层组明显高于含HFCL滋养层组［第5周CFU- GM集落数（129.95±8.73）个/105接种细胞数 vs （89.81±10.29）个/105接种细胞数(P<0.05）］； HFCL滋养层组无论有否细胞因子，自第3周后各个时间点集落形成数无明显差别（P>0.05）；含细胞因子的MSC滋养层组各个时间点集落形成数都高于单纯MSC滋养层组［第5周CFU- GM集落数（192.93±4.95）个/105接种细胞数 vs （90.47±14.28）个/105接种细胞数(P<0.01）］。细胞因子组在第2-3周集落数显著下降，至第5周末见集落生长。单纯CD34＋细胞组第2周后即未见有集落形成（图2）。这一结果说明MSC体外长期维持CD34+细胞LTC- IC的能力明显优于基质细胞，尤其在有细胞因子的情况下，其作用更为明显。
MSC与HFCL适当比例混合，体外支持脐血CD34+细胞生长的作用更佳
从图3中看出，MSC与基质细胞共同作为滋养层，单纯MSC对CD34+细胞的体外支持造血作用优于单纯HFCL，符合前述实验结果。这种支持作用在MSC所占比例超过1/4后有显著增强(P＝0.012)，并在MSC与HFCL比例为4∶1时达到高峰，集落形成数量为（186.89±11.11）个/105接种细胞数，明显高于二者比例为3∶2组的（131.45±13.02）个/105接种细胞数和单纯MSC组的（138.92±14.84）个/105接种细胞数（P＝0.005)。
讨论
20世纪70年代初Friedenstein［3］首先提出了造血诱导微环境(hematopoietic inductive microenviroment， HIE)的概念。骨髓基质细胞、细胞外基质和细胞因子是HIE的重要组成部分，其中基质细胞因是分泌基质与细胞因子的主体而成为支持造血的关键环节。接受HSC移植者因放、化疗导致骨髓基质损伤，这大大地削弱了移植后造血重建。Galotto等［4］将HSC移植后受者成纤维细胞集落形成单位（colony- forming units fibroblast； CFU-F）与正常供体CFU- F相比较，发现HSC移植受者骨髓CFU- F集落数降低了60%- 90%（P＜0.05），5岁以上受体移植后12年CFU- F集落数仍不能恢复正常，并且低水平CFU- F患者的骨密度降低，长期培养起始细胞（long- term culture- initiating cells； LTC- IC）也明显减少。修复和替换由遗传突变或外来因素造成的基质损伤可促进造血［4，5］。动物实验表明，来自健康供者的基质细胞与HSC共移植既可改善HSC植入率又可加快造血恢复。Almeida- Porada等［6］将成年羊基质细胞与HSC共移植给胎羊，移植后HSC植入增加，造血显著增强达30月余。体外培养中，即使是单一基质细胞作为滋养层也能够促进CD34+细胞增殖，同时维持其干细胞特性，便如可使LTC- IC数量比单用多种细胞因子组合者增加3-5倍［1， 7，8］。骨髓MSC是骨髓各种基质细胞的前体细胞，据推测同骨髓基质细胞一样具有促进CD34+细胞增殖、分化和维持LTC- IC能力。 Wang等 ［9］和Bensidhoum等 ［10］先后报道，用骨髓MSC作滋养层可进行大体积的人脐血来源的HSC短期扩增，动物实验中MSC能够促进人脐血来源的CD34+在NOD/SCID体内的植入。Majumdar等［2］发现，以骨髓MSC作滋养层的扩增体系可明显扩增人骨髓CD34+细胞和小鼠的HSC中的LTC- IC。然而，MSC本身即具备干细胞特征，它与一般的基质细胞系相比，是否对造血干/祖细胞的扩增作用更佳？国内外报道很少，且没有达成一致观点。我们以培养扩增的人骨髓MSC为滋养层，以来源于胎儿骨髓的已证明具有体外支持造血作用的成纤维细胞样基质细胞系HFCL滋养层作对照［1］，观察MSC对脐血CD34+细胞的增殖作用，尤其是维持LTC- IC形成CFU- GM的能力，为体外扩增CD34+细胞的研究和后续动物体内实验奠定基础。本研究首先通过实验确定了既停止滋养细胞增殖又不影响其存活的最佳照射剂量。结果表明，以较低剂量率（20 cGy/min）、1 500 cGy γ线照射MSC和HFCL后未见细胞脱落，培养1周后无明显增殖亦未见衰老和死细胞出现，达到预期的制备滋养层目标（资料未显示）。实验结果显示，在细胞因子存在的情况下，CD34+细胞在不同滋养层上培养12天后，扩增细胞数量明显不同，HFCL滋养层组的扩增数量最高，细胞总数增加至（9797±361）%，明显高于MSC滋养层组的（7061±418）%及其它各组（均P<0.01）；在没有细胞因子存在时，HFCL滋养层组扩增细胞数至（5305±354）%，也明显高于MSC滋养层组的(1992±247)% 和细胞因子组的（2383±347）%，但较有细胞因子MSC滋养层组低（P<0.01），这说明HFCL支持脐血CD34＋细胞的增殖能力优于MSC，在细胞因子协同作用下，增殖作用更加明显，CD34+细胞也增加至（1617±222）%，明显高于MSC滋养层组的（939±212）% 及其它各组（均P<0.01）。观察MSC体外维持脐血CD34+细胞LTC- IC的能力，含MSC滋养层组在第2－8周CFU- GM明显高于含HFCL滋养层组（均P<0.01）；含细胞因子的MSC滋养层组各个时间点集落形成数又都高于单纯MSC滋养层组（P<0.05）。该结果与Kozik等［11］和Boiret等［12］报道的结果相近，说明MSC体外长期维持脐血中LTC- IC的能力明显优于单一的成纤维细胞样基质细胞，尤其在有细胞因子的情况下，其作用更为明显。进一步研究发现，将MSC与HFCL以固定细胞总数混合作为滋养层，随着MSC所占比例超过1/5，其支持CD34+形成的GM- CFU数量也有显著增加。特别是当MSC与HFCL的比例为4∶1时，GM- CFU形成数量最高，高于单纯MSC滋养层组。总之，MSC维持长期造血重建的能力强于单一的成纤维细胞样骨髓基质细胞系HFCL，并与一定比例的HFCL有协同促进造血作用，促进GM- CFU形成数量达最高峰，这可能与不同发育阶段的骨髓基质细胞群分泌造血因子的种类和数量不同有关［13， 14］。应当指出的是，骨髓基质细胞群是由多种细胞组成的，而成纤维样基质细胞系只是其中之一种细胞，本研究以其为已知的体外支持造血的基质细胞成分，作为参照研究MSC的体外支持造血作用。MSC是骨髓基质细胞的前体细胞，可能较单一成分的成纤维样基质细胞系分泌更多活性物质，提供LTC- IC更完好的生存微环境，比如分泌基质细胞衍生因子- 1(SDF- 1)等，对造血干/祖细胞的扩增起重要作用，但其确切机理有待进一步深入探讨。这一结果也为应用MSC进行CD34+细胞体外扩增及MSC联合造血干细胞共移植提供了实验依据。
【】
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