D-柠檬烯对K562细胞增殖及凋亡的影响

【摘要】  　　本研究探讨D-柠檬烯对K562白血病细胞增殖的影响及机制。应用MTT试验观察不同浓度D-柠檬烯作用后K562细胞增殖的改变；应用细胞形态学检查、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡。结果表明： 在0.125-1.0 mmol/L浓度范围内，D-柠檬烯对K562细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖的关系。 典型的细胞形态学改变、DNA琼脂糖凝胶电泳梯形条带及流式细胞仪检测出亚G1峰共同证实了D-柠檬烯能诱导K562白血病细胞凋亡。结论： D-柠檬烯抑制K562细胞的增殖并呈剂量依赖的方式，使细胞滞留于G1期，诱导其凋亡。

【关键词】  D-柠檬烯； K562细胞； 细胞凋亡； 细胞增殖

　　Proliferation Inhibition and Apoptosis Induction of K562 Cells by D-limonene

　　AbstractThis study was aimed to investigate the effect of D-limonene on K562 leukemia cells and its mechanism. Inhibitory effect of D-limonene on proliferation of K562 leukemia cells was assayed by MTT method and cell apoptosis was detected  by flow cytometry and DNA agarose gel electrophoresis, the morphologic change of K562 cells was observed by microscopy. The results showed that when K562 cells were treated with 0.125-1.0  mmol/L of D-limonene for 48 hours, the proliferation of K562 cells was obviously inhibited in dose-dependent manner. Typical morphological changes and the typical DNA ladder on agarose gel electrophoresis  for analysis of cellular apoptosis were significantly appeared  in D-limonene treated K562 cells. Simultaneously, the sub-G1 peak was found in FCM analysis.  It is concluded that the  D-limonene can inhibit  proliferation of K562 cells in dose-dependent manner, cause  cell detained at  G1 phase and induce apoptosis of K562 cells.

　　Key wordsD-limonene;  K562  cell;  cell apoptosis;  cell proliferation

　　D-柠檬烯（D-limonene）是一种单萜烯类化合物，广泛存在于芸香科柠檬、柑桔精油及其他植物中，具有抗氧化、抗炎、利胆溶石等作用。近年来，人们发现D-柠檬烯具有抗癌活性，用于预防及化学致癌物诱导的结肠癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、皮肤癌、肝癌等［1-6］ ，取得了一定的效果。目前对其抗癌作用的研究主要集中在实体瘤方面，对非实体瘤作用的研究报道尚少。我们以K562白血病细胞作为靶细胞，探讨D-柠檬烯对其抑制增殖、诱导凋亡的作用。

　　材料和方法

　　主要试剂

　　RPMI 1640培养液（Gibco公司产品）；小牛血清（杭州四季青公司产品）；淋巴细胞分离液（密度1.077，上海试剂二厂生产）；溴化噻唑蓝四唑（thiazolyl blue tetrazolium bromide， MTT）和D-柠檬烯（Sigma公司产品）。

　　细胞系和细胞培养

　　K562细胞株由大连医科大学组胚教研室提供，K562细胞悬浮于含15%小牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃、 5% CO2、饱和湿度的培养箱内培养，每2-3天传代1次，取对数生长期细胞调成适当浓度进行实验，台盼蓝拒染率＞95%。

　　细胞增殖抑制的MTT测定

　　2×104/ml K562细胞悬液接种于96孔培养板，每孔
0.2 ml。实验组：加不同浓度D-柠檬烯；对照组：加与D-柠檬烯等体积培养液；空白组只有培养液，无细胞。每组设6个复孔。置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱内培养48小时后，每孔加入新配置的MTT（5 mg/ml）10 μl，混匀，继续孵育4小时，离心，弃培养上清，加入200 μl二甲亚砜，震荡5分钟，酶标仪测570 nm处OD值。按下述公式抑制率。

　　抑制率=［（A对照-A实验）/（A对照-A空白 ）］×100%

　　形态学观察

　　取培养后2、4、6天的细胞洗涤2次后，涂片，干燥，Wright-Giemsa染色，1 000倍油镜下观察细胞形态有无凋亡特征变化。

　　流式细胞术检测

　　收集D-柠檬烯作用48小时后的细胞，用PBS液洗涤2次，缓慢加入-20℃预冷的70%乙醇1 ml固定1小时。再用PBS液洗2次，将等体积的细胞悬液和用含RNA酶的碘化丙锭（PI）5 μg/ml、  4℃染色30分钟，以激发波长488 nm测定，并用ModfitLT 2.0软件分析细胞周期分布。低于G0/G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。

　　DNA琼脂糖凝胶电泳分析

　　收集D-柠檬烯作用后2×106个细胞，经PBS洗涤，提取DNA，样品溶于少量TE中，UV160紫外分光光度计测定260 nm光吸收值，DNA上样量为4 μg/lane，经1.5%琼脂糖凝胶 (含0.5 μg/ml溴化乙锭)电泳，70 V，2小时，紫外灯下检测并摄片。

　　统计学方法

　　应用SPSS 10.0统计软件，采用卡方检验进行数据分析。

　　结果

　　D-柠檬烯对K562细胞增殖的抑制作用

　　结果见附表。由附表可见，0.25 mmol/L D-柠檬烯即可明显抑制K562细胞生长，浓度0.5 mmol/L时抑制率达59.94%。

　　D-柠檬烯对K562细胞凋亡的诱导

　　显微镜观察结果空白对照组中K562细胞呈原始未分化状态，细胞大而圆，胞质少，胞核大，核/质比例大，核染色质细腻，见核仁。0.25 mmol/L作用24-48小时后，可见部分细胞呈现典型的细胞凋亡形态，即核固缩、包膜突起，并见到凋亡小体（图1）。
Table.  Effect of D-limonene on proliferation of K562 cells (略)

　　流式细胞术检测结果由图2可见，D-柠檬烯作用K562细胞24小时，出现反映凋亡的典型"Apo"亚峰。D-柠檬烯诱导的细胞周期阻断于G1期。

　　凋亡细胞的DNA片段琼脂糖凝胶电泳结果由图3可见，D-柠檬烯0.5 mmol/L处理K562细胞48小时后，DNA裂解为180-200 bp及其倍数的片段，琼脂糖凝胶电泳获得清晰的凋亡特征性梯形条带（ladder）；对照组细胞DNA完整，无DNA梯形条带；D-柠檬烯1.0 mmol/L组则呈成片条带，说明细胞为坏死反应。

　　讨论

　　细胞凋亡是在基因控制下的细胞自我消亡过程，是区别于细胞坏死的另一种细胞死亡方式，其形态学及生物化学改变具有自身特点。大量研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞增殖异常有关，而且与细胞凋亡异常有着密切关系，与细胞增殖和癌变有关的原癌基因和抑癌基因都参与了对细胞凋亡的调控，如bcl-2 、p53 、bax 等［7，8］。D-柠檬烯是从柑橘类植物提炼的天然单萜类化合物，作为低毒性的食用性抗癌药物，在近年来受到普遍关注。一般认为，其抗癌的主要机理在于抗氧化、解毒、促进癌细胞凋亡等方面。1999年Uedo等 ［9］ 发现，D-柠檬烯能通过增加肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞DNA合成而达到抑制胃肠道肿瘤的作用。路小光等［10］发现，经 D-柠檬烯处理后的胃癌细胞与对照组比较，细胞内p53表达明显增加，bcl-2 表达明显降低。本实验选用K562细胞作为试验细胞，在体外观察了D-柠檬烯的抗肿瘤作用。在0.125-1.0 mmol/L浓度范围内，D-柠檬烯对K562细胞的增殖有的抑制作用并呈剂量依赖关系，细胞形态学改变、DNA琼脂糖凝胶电泳条形梯带的出现和流式细胞仪检测亚G1峰的检出等，均证实D-柠檬烯有诱导白血病细胞凋亡的作用。D-柠檬烯对白血病细胞增殖的抑制作用可能是通过诱导其凋亡而实现的，但在浓度大于1.0 mmol/L时则出现细胞坏死。本研究通过K562细胞株体外实验初步得出了D-柠檬烯有诱导白血病细胞凋亡的作用，但诱导凋亡发生的机理、影响其基因表达的因素还有待进一步研究。

【】
  　　1 Raphael TJ, Kuttan G. Effect of naturally occurring monoterpenes carvone, limonene and perillic acid in the inhibition of experimental lung metastasis induced by B16F-10 melanoma cells. J Exp Clin Cancer Res, 2003; 22: 419-424

　　2 Chen X, Yano Y, Hasuma T, et al. Inhibition of farnesyl protein transferase and P21ras memebrane association by d-limonene in human pancreas tumor cells in vitro. Chin Med Sci J, 1999; 14:138-144

　　3 Hakim IA, Harris RB, Ritenbaugh C. Citrus peel use is associated with reduced risk of squamous cell carcinoma of the skin. Nutr Can- cer, 2000; 37:161-168

　　4 Giri RK, Parija T, Das BR. d-limonene chemoprevention of hepatocarcinogenesis in AKR mice: inhibition of c-jun and c-myc. Oncol Rep, 1999; 6:1123-1127

　　5 Haag JD, Lindstrom MJ, Gould MN. Limonene-induced regression of mammary carcinomas. Cancer Res, 1992; 52: 4021-4026

　　6 Stratton SP , Dorr RT, Alberts DS. The state-of-the-art in chemoprevention of skin cancer. Eur J Cancer, 2000; 36: 1292-1297

　　7 周永列，邱莲女，林惠君等. Bcl-2,Bax和线粒体膜蛋白在一氧化氮供体诱导HL-60细胞凋亡中的改变. 实验血液学杂志,2004；12:445-449

　　8 杨清明, 陈丽贞. 细胞凋亡及其在肿瘤学的意义. 中国肿瘤临床与康复, 1997; 4: 88-89

　　9 Uedo N, Tatsuta M, Iishi H, et al. Inhibition by D-limonene of gastric carcinogenesis induced by N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine in Wistar rats. Cancer Lett, 1999; 137:131-136

　　10 路小光, 冯秉安, 战丽彬等. 右旋柠烯诱导人胃癌细胞凋亡. 中华肿瘤杂志, 2003; 25: 325-327