多克隆细胞系的研究价值 ——J6?1人白血病细胞系30年研究评述
作者：吴克复， 郑国光， 马小彤
【摘要】 J6?1细胞系是我国建立的第一株人白血病细胞系，是EBV和HHV?6双重感染的多克隆细胞系。J6?1细胞系建系30年来，从J6?1细胞克隆了许多细胞因子、受体及其他基因，提供了许多有关白血病细胞性质和功能的信息，从而衍生出多项研究课题，而所有这些显示出多克隆细胞系特有的研究价值。本文就30年来J6?1人白血病细胞系的研究作一评述，包括J6?1细胞系的异质性和多克隆性，J6?1细胞群体的生存机制和J6?1细胞系的异常细胞间通讯及其意义，以及J6?1细胞系的启示。
【关键词】 白血病细胞系
Research Value of Multi?clone Cell Line： A Comment for the 30th Anniversary of J6?1 Human Leukemic Cell Line ——Editorial
Abstract J6?1 cell line is the first leukemic cell line established in China. It is a multi?clone cell line infected with both EBV and HHV?6. Many cytokines, receptors and other genes were cloned from J6?1 cell line since its establishment 30 years ago. Valuable information on leukemic characteristics and functions were obtained from the studies on this cell line, which could be categorized into several research subjects. These achievements implied the unique research value of multi?clone cell lines. This comment focuses attention on research advance of the J6?1 leukemic cell line in 30 years, including heterogeneity and multi?cloning of J6?1 cells, survival mechanism of J6?1 cell populations, abnormal intercellalar communication of J6?1 cells with its significance and inspiration from J6?1 cell line.
Key words leukemic cell line; multi?clone cell line; herpes virus infection; leukemic cells characterization
通常都认为细胞系是单克隆的，或者经过单克隆化的，是分析性实验研究和生物工程生产的常用工具。但是，有些细胞系实际上是多克隆的，例如由人类疱疹病毒4型Epstein?Barr病毒（EBV）转化正常B淋巴细胞形成的淋巴母细胞样细胞系（lymphoblastoid cell line, LCL）是公认的多克隆细胞系，即由EBV同时转化多个正常的B淋巴细胞而成。LCL作为容易建系和培养的人类细胞模型在20世纪70-80年代的生物学和医学研究中发挥过很大作用，现在已经成为保留人类个体基因组的常规工具。但是作为严格的分析性研究，多克隆细胞系不是适宜的实验模型，近十多年来分子和细胞生物学研究已很少采用多克隆细胞系。J6?1是我们实验室在1976年建立的我国第一株人类白血病细胞系［1］，为EBV和人类疱疹病毒?6型(HHV?6)双重感染的多克隆细胞系［2］，30年来J6?1细胞系提供了大量有关白血病细胞性质和功能的信息，在长期研究中我们体会到多克隆细胞系有其独特的性质，应该继续发挥其研究价值。
J6?1细胞系的异质性和多克隆性
从J6?1细胞系建系开始的细胞群体就表现出明显的异质性。培养初期以异型粒系和单核系细胞为主，随着传代次数的增加异型粒系细胞迅速减少，逐渐形成以淋巴样和单核样细胞为主的两大类细胞亚群，并伴有大量双核镜影细胞（Reed?Sternberg， R?S细胞）。培养前患者的骨髓标本，显微镜对其观察发现有疱疹病毒样颗粒，结合患者发病时有颈部包块，推测由Hodgkin淋巴瘤成急性白血病。从建系后的性质看J6?1细胞系应该分类为Hodgkin淋巴瘤细胞系［3］，按国际上通用的分类，属人类白血病细胞系。与J6?1细胞系性质相似的细胞系有德国学者于1986年建立的Croco II，也是EBV和HHV?6双感染的人白血病细胞系，由于Croco II感染的是EBV?1型，所以细胞增殖比感染EBV?2型的J6?1旺盛［2］。
多克隆细胞系的研究价值J6?1细胞群体的异质性表现在多方面：形态学观察大体上可分为淋巴样细胞、单核样细胞、R?S细胞和多核细胞；表面抗原分析显示，几乎所有的J6?1细胞都有HHV?6早期膜抗原的高表达，同时有CD45和CD54以及HLA?DR的表达；按照表面抗原标记可以大体上分为两个亚群：高表达CD19+和CD20+的B淋巴样细胞亚群和CD15+的单核样细胞。值得注意的是J6?1细胞群体中可测出少数其他系列表面抗原的表达，如GlyA和CD34。有时甚至能分选出少量CD34+细胞。J6?1细胞群体的异质性反映出它的多克隆性，与LCL的异质性类似，但是比LCL更复杂，酷似Hodgkin淋巴瘤的状况。
J6?1细胞群体的多克隆性表型除了表面抗原呈现不同亚群外，用极限稀释法进行单个细胞培养从未成功；用96孔培养盘能够成功增殖繁衍J6?1细胞群体的最低细胞数是500细胞/孔，提示J6?1细胞群体中各不同细胞间的相互依赖性。
J6?1细胞群体的生存机制
J6?1细胞的生长繁殖除了要求较高的细胞浓度外，最明显的是接触依赖，即成丛生长。对成丛生长的深入研究发现，J6?1细胞表面高表达膜结合型M?CSF及其受体，由此提出了肿瘤和白血病细胞增殖的接触性刺激假设［4,5］，即J6?1细胞通过膜结合型M?CSF及其受体相互刺激，表达多种与细胞增殖相关的细胞因子和癌基因，对这种双向信息转导的机制我们实验室正在研究中。
研究表明，J6?1细胞的膜结合型M?CSF高表达与HHV?6感染相关，在白血病患者骨髓单个核细胞中加入HHV?6能明显增加HHV?6早期膜抗原的表达，不久证明HHV?6早期膜抗原就是膜结合型M?CSF［6］。后来还从J6?1细胞克隆出EB病毒功能性巨噬细胞集落刺激因子受体基因BARF1［7］，提示J6?1细胞由膜结合型M?CSF及其受体介导的接触性调节机制与EBV和HHV?6两类疱疹病毒的双重感染有关，并导致了多种细胞因子和癌基因的表达和丰富多彩的表型。
J6?1细胞系的异常细胞间通讯及其意义
细胞间通讯是细胞生存及功能所必需的，白血病细胞间以及与正常细胞间异常的细胞间通讯在白血病的发生、发展中起十分重要的作用。J6?1这类多克隆细胞系中存在着复杂的细胞间通讯，与单克隆细胞系比较，更接近白血病细胞在体内的状态，是进行此类研究的良好模型。从J6?1这个模型入手发现了许多异常的细胞间通讯，为深入研究白血病细胞的异常细胞间通讯提供了有益的线索，深入的研究发现，其中一些异常的细胞间通讯在白血病、肿瘤等恶性疾病中广泛存在的，在白血病、肿瘤的发生、发展中起一定的作用。
J6?1细胞系表达众多的细胞因子及其受体［8］，有的形成自激机制，如M?CSF及其受体；有的是旁分泌，如TNF?α和TGF?β。经过对临床病人标本的检测，这些细胞因子和癌基因在白血病患者中都有不同程度的高表达，在白血病发生发展中起重要作用。
我们实验室从J6?1细胞克隆出M?CSF及其受体的cDNA［9］；用J6?1细胞膜分离M?CSF及其受体的蛋白，制备出单克隆抗体［10,11］，用这些单克隆抗体为探针检测病人标本发现，异型M?CSF及其受体不仅在多种白血病，尤其是髓系白血病和Hodgkin淋巴瘤有高表达［12?14］，而且在肝癌和乳腺癌细胞也有高表达，并有预后意义［15］。深入研究表明，异型M?CSF及其受体不仅出现在肿瘤细胞表面，而且细胞内尤其是细胞核内的异型M?CSF及其受体与肿瘤的恶性程度相关；细胞内的小分子M?CSF可以起着细胞内自激因子作用，直接调节基因表达［16-18］。膜结合型M?CSF通过调节基质金属蛋白酶的表达影响肿瘤细胞的迁移和浸润能力［19］。从对M?CSF及其受体的系统研究，我们体会到生物大分子在分子水平的多样性，是生物多样性的基础，也是疾病和病理变化的基础［20］。针对异型M?CSF及其受体的肿瘤相关性，我们实验室研制了以M?CSF及其受体为靶标的性DNA疫苗，在实验动物有明显的治疗效果［21,22］。
除了上述刺激细胞增殖的因子外，J6?1细胞也有多种负调节因子的高表达，如TNF?α、TGF?β和LIF等，成为研究负调节因子作用机制的体外模型 ［8,23-25］；此外，从J6?1细胞中还分离出对白血病细胞有抑制作用的小分子RNA［26］。
我们实验室从J6?1细胞系克隆出了新型白细胞介素18（IL?18）及其受体［27］，成为研究IL?18在白血病细胞中作用机制的适宜模型［28,29］。后来用IL?18肿瘤疫苗治疗小鼠L1210白血病取得了十分明显的治疗效果，并有一定的复发预防效应［30］。
多肽抗生素LL37/hCAP18是天然免疫的重要成员，除对微生物有杀伤活性外，还有白细胞趋化活性。我们首先从J6?1细胞入手，克隆出了LL37/hCAP18，但发现其蛋白生物活性不高，提示有表达缺陷［31］；然后测定了血液病患者外周血白细胞的LL37/hCAP18表达，证实其在白血病患者中的低表达与感染相关，且可能是白血病患者易于感染的机制之一［32］。进一步用LL37/hCAP18与MAF?J6?1融合基因制备的肿瘤疫苗可以明显提高抗肿瘤效应，提示LL37/hCAP18不仅有天然抗生素作用，而且还是重要的免疫分子佐剂，有免疫增强作用［33］。
核苷酸类物质是新近阐明的细胞间通讯载体，可通过P2X家族嘌呤受体向胞内传递信号，包括J6?1细胞在内的多数白血病细胞系至少表达一种P2X家族受体，提示核苷酸类物质介导的细胞间通讯广泛存在于白血病细胞中［34］。深入研究P2X7受体发现，其高表达与白血病的治疗相关，J6?1、LCL等白血病细胞中P2X7受体的功能异常［35］；进一步研究其机制发现，多种机制造成其功能异常，CD39相关的高ATP酶活性是LCL细胞P2X7受体功能异常的原因［36］。目前我们已从J6?1细胞中克隆了P2X7受体［37］，P2X7受体及其功能异常在白血病发病学中的作用和机制正在研究中。
J6?1细胞系的启示
虽然J6?1是多克隆细胞系，但是与LCL类似，在若干代数内能保持基本性状恒定，是应用多克隆细胞系进行体外实验研究的基础。
与实体瘤细胞不同，白血病细胞在体内处于高度异质性细胞的微环境中。骨髓微环境是异质性的；外周血中有大量的红细胞、各种白细胞和少数基质细胞，这些细胞对白血病细胞有各种影响。体外培养细胞的原理是模拟体内微环境，要全面模拟白血病患者的微环境是不容易的，细胞培养技术只能符合少数白血病细胞的生长条件，所以白血病细胞的建系率低。分析已建立的常用白血病细胞系都是肿瘤性很强的。众所周知，肿瘤性越强自发性突变频率越高，正常细胞突变频率约10-6，通常肿瘤细胞突变频率约10-3至10-4，恶性度高的肿瘤细胞系如HeLa可高达10-2。高突变频率的细胞系在快速传代过程中，在常规培养方法微环境选择压的作用下容易产生亚克隆，如由于培养方法的差异（培养液、血清不同、培养温度和培养器皿不同等）不同实验室传代保存的K562, HL?60等人白血病细胞系可以有较大的差别，形成亚系。如有非T非B的K562，也有具有红系特征的K562或粒系特征的K562等。异质性细胞系群体的不定向变异即遗传漂变，有人利用细胞系的遗传漂变筛选某种特定性状的克隆，如耐药细胞株（按照细胞培养的术语，能保持某种性状不变的细胞系称为细胞"株"。如人二倍体细胞株是指保持二倍体性状不变的；耐药细胞株是指保持对某药耐药的）。总之，肿瘤细胞的遗传不稳定性使肿瘤细胞系的单克隆性倍受质疑，随着传代次数的增多实际上成了多克隆细胞系。研究者根据实验要求必要时应该进行亚克隆。
结束语
回顾30年来对J6?1细胞系的研究，观察到了在EBV和HHV?6双重病毒感染下，J6?1表现出若干人白血病细胞克隆的演变和生物学性质和行为，提供了许多有关白血病细胞的信息。J6?1细胞系可能更接近于双表型白血病和Hodgkin淋巴瘤的体内状况。
国际通用的人白血病细胞系都来源于分化程度较低、恶性度高的白血病，表达的细胞因子、癌基因较少；J6?1细胞系在两种疱疹病毒感染下表达更多的细胞因子、癌基因，更接近于前炎症状态［38,39］，这些是多克隆细胞系的优势，适用于相关课题，如病毒病因、发病机制、免疫状态、细胞因子等的体外研究；机体作为高度复杂的细胞社会由不同的细胞群体按照一定的规则组成和运行［40］，多克隆细胞系也可作为研究不同细胞间相互关系的体外模型。
【】
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