川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经元内Caspase?3表达的平均光密度和阳性面积率
【摘要】 目的: 探讨川芎嗪(TMP)对青霉素致痫大鼠大脑神经元内Caspase?3表达的平均光密度及阳性面积率的变化。方法: 使用青霉素致痫大鼠模型, 采用BL ?410生物机能实验系统记录双侧大脑皮层痫样放电, 待癫痫样放电稳定后, 腹腔注射不同剂量的TMP, 待其抑制作用最明显时, 取大脑切片,观察大脑神经元内Fas表达的变化。结果: TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元内Caspase?3表达的平均光密度及阳性面积率显著降低。结论: TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元有明显的保护作用。
【关键词】 川芎嗪； 癫痫放电； 神经元； 青霉素； Caspase
川芎嗪, 化学结构为四甲基吡嗪( tet ramethylpyrazine,TMP)。TMP可抑制海马神经元的放电活动, TMP可明显抑制吗啡依赖大鼠戒断症状及体重下降［1］,大剂量TMP对缺血、缺氧性脑损伤、海马CA1神经元的缺血性损伤有改善或保护作用［2,3］。TMP已被广泛应用于心、脑血管闭塞性疾病的［4］。Caspase?3是在调控细胞凋亡过程中的比较重要的蛋白质，Caspase?3是Caspase家族中比较重要的一员。Caspase是cysteine?containing aspartate specific protease的缩写，即含半胱氨酸的天冬氨酸特异水解酶。Caspase家族是一组蛋白水解酶，其特点是：①它们都有发挥酶活性所必须的半胱氨酸；②都能特异地裂解天冬氨酸位点；③前体蛋白均无活性，均需经蛋白水解后才产生活性；④转染不同细胞可诱导凋亡。根据其发现的顺序给予编号，迄今为止共发现了14个成员。根据Caspase 的一级结构和介导蛋白质-蛋白质相互作用的N末端的原结构域，可将其分为2类：①启动子Caspase，如Caspase?8、Caspase?9和Caspase?10，它们通过自身催化而激活；②效应子Caspase，如Caspase?3、Caspase?6和Caspase?7，它们能分解细胞蛋白，起凋亡执行器的作用。目前认为Caspase是一切凋亡信号传导的共同通路，各种Caspase如同凝血因子一样“瀑布式”(cascade)层层激活，最终引发细胞凋亡［5～7］。
本课题采用免疫组织化学方法、图像分析技术检测了TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元内Caspase?3表达的平均光密度及阳性面积率的变化影响, 并进一步探讨其作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 SD大鼠(由武汉大学医学院实验动物中心提供) , 雌雄不拘, 体重200～ 250g。
1.1.2 实验药品及试剂 盐酸川芎嗪注射液( 批号0107001 ) , 常州制药厂生产；注射用青霉素钠( 批号00109306) , 华北制药股份有限公司生产。
1.1.3 实验仪器 BL?410 生物机能实验系统, 成都泰盟有限公司生产；江湾I?C型立体定向器, 第二军医大学器材处生产。
1.2 方法
1.2.1 癫痫动物模型 实验选用健康SD 大鼠, 用10% 乌拉坦以10m l·kg-1体重腹腔注射( ip ) 麻醉, 将动物固定在江湾I?2C 型立体定向器上,于大脑左、右两侧前卤后3mm , 矢状缝旁开3mm 行开颅手术, 暴露大脑皮层记录区域(2mm ×2mm),将银球电极置于左、右两侧的记录部位,信号输入置BL?410 生物机能实验系统, 进行左、右两侧脑电记录。用浸有青霉素溶液的明胶海绵(200u/mm3)置于左侧大脑皮层表面, 诱发大鼠大脑皮层癫痫样放电, 待癫痫放电稳定后, 移去明胶海绵, 用浸有温热生理盐水棉球盖住创口。
1.2.2 试验分组及取材 将实验大鼠随机分为5组, 每组8只: ①A 组(手术对照组) , 麻醉开颅手术1h后取大脑; ②B组(青霉素致痫组),青霉素诱发癫痫1h后取大脑； ③C组(TMP10mg·kg-1治疗组),青霉素诱发癫痫放电稳定后,再腹腔注射TMP(10mg·kg-1),待抑制作用最明显时取大脑； ④D组(TMP 20mg·kg-1治疗组),青霉素诱发癫痫放电稳定后, 再腹腔注射TM P (20mg·kg-1),待抑制作用最明显时取大脑；⑤E组(TMP40mg·kg-1治疗组),青霉素诱发癫痫放电稳定后,再腹腔注射TMP(40mg·kg-1),待抑制作用最明显时取大脑。
1.2.3 HE染色 常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚约4μm)及HE染色。
1.2.4 免疫组织化学S?P法检测Bcl?2相关抗原
主要步骤：
① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；
② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；
③ Bcl?2采用微波抗原修复（3档，10 min），PBS洗4×5min；
④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；
⑤ 一抗（Bcl?2，1:50 )37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；
⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
⑦ 链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；
⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；
⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。
用PBS代替一抗作为阴性对照组，人扁桃体作为Bcl?2的阳性对照组。
1.3 免疫组织化学结果判断
Caspase?相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。
采用HPIAS?2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对Caspase?2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。
1.4 统计学处理
对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK?q检验，检验水准α为0.05。
2 结果
Caspase?3的表达 A 组(手术对照组) : 大脑皮层神经元胞浆内可见少量棕黄色颗粒，Caspase?3表达弱；B 组(青霉素致痫组) : 大脑皮层神经元胞浆内可见较多的棕黄色颗粒沉积，Caspase?3表达强；C 组(TMP 10mg·kg- 1组) : 与手术对照组比较大脑皮层大脑皮层神经元胞浆内可见棕黄色颗粒沉积，Caspase?3强表达； D组(TMP20mg·kg-1治疗组) : 与手术对照组比较, 大脑皮层神经元胞浆内可见少量棕黄色颗粒，Caspase?3表达弱； E组(TM P40mg·kg-1治疗组) : 与手术对照组比较, 大脑皮层神经元胞浆内可见少量棕黄色颗粒，Caspase?3表达弱。图像分析结果显示：A 组(手术对照组) Caspase?3表达的平均光密度为0.0524±0.0143；B 组(青霉素致痫组) Caspase?32表达的平均光密度为0.1580±0.0324；C 组(TM P 10mg·kg-1治疗组) Caspase?3表达的平均光密度为0.1627±0.02853；D组(TMP20mg·kg-1治疗组) Caspase?3表达的平均光密度为0.0452±0.0123；E组(TM P40mg·kg-1治疗组) Caspase?3表达的平均光密度为0.0543±0.0225。A 组(手术对照组) Caspase?3表达的阳性面积率为0.1624±0.0234，B 组(青霉素致痫组) Caspase?3表达的阳性面积率为0.3024±0.0410，C 组(TMP 10mg·kg-1治疗组) Caspase?3表达的阳性面积率为0.3209±0.0330；D组(TMP20mg·kg-1治疗组) Caspase?3表达的阳性面积率为0.1403±0.0138；E组(TM P40mg·kg-1治疗组) Caspase?3表达的阳性面积率为0.1543±0.0263。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01)。经q检验，A组(手术对照组)与B组(青霉素致痫组)、C 组(TM P 10mg·kg-1治疗组)之间Caspase?3的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.01)，A 组(手术对照组)与D组(TMP20mg·kg-1治疗组)、E组(TMP40mg·kg-1治疗组)之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P＞0.05），B 组(青霉素致痫组)与C组(TM P 10mg·kg-1治疗组)之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P＞0.05），D组(TMP20mg·kg-1治疗组)与E组(TM P40mg·kg-1治疗组)之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性（P＞0.05）。见表1。
表1 各组Caspase?3表达的平均光密度和阳性面积率（略）
注： * A组与B组、C 组比较，P＜0.01；** A组与D组、E组比较，P＞0.05；△ B组与C组比较，P＞0.05；## D组与E组比较，P＞0.05；# B组与D组、E组比较，P＜0.01。
3 讨论
青霉素致大鼠癫痫模型是一种极为有效的、操作简便的实验动物癫痫模型, 其癫痫放电持久稳定, 可以用作抗癫痫药物疗效及癫痫发病机制的研究［8］。青霉素诱发的癫痫电活动是阻断了GABAa受体导致抑制神经功能失调而产生癫痫状态的［9］。细胞凋亡(apoptosis)［9］是多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定由基因调控的细胞主动死亡过程，它是细胞在一定条件下，通过启动其自身内部机制，引起内源性DNA内切酶的激活而发生细胞的死亡。细胞凋亡的过程不导致溶酶体及胞膜的破裂，没有细胞内涵物外泄，所以不引起炎症反应。
在Caspase级联反应中，Caspases?3处于核心位置。Caspases?3被其上游信号激活，活化的Caspases?3又进一步作用于其底物导致Caspase级联反应放大，最终使细胞凋亡。Caspases?3作用的底物主要有聚ADP?核糖聚合酶（poly ADP?ribose polymerase, PRAP）、DNA依赖性蛋白酶催化亚单位（DNA? PKcs）、DNA断裂因子（DNA fragmentation factor, DFF）的45 kD亚基、蛋白激酶C δ（protein kinase C δ, PKC δ）和核纤层蛋白（lamin）等［11］。上述Caspases?3作用的底物中，有的是与细胞凋亡过程直接相关的一些酶，例如：PRAP是DNA修复酶，PRAP的裂解是细胞凋亡发生最有价值的标志物；有的是细胞的结构蛋白，例如lamin是细胞核膜的重要结构蛋白，其在核膜完整和间期染色质形成中起重要作用。
已有的研究表明，Caspases?3是Fas介导细胞凋亡蛋白酶级联反应中的“核心”蛋白酶，抑制Caspases?3酶活性或拮抗Caspases?3功能可使Fas介导的细胞凋亡受抑，说明Caspases?3对Fas介导的细胞凋亡是必需的［12］。
本实验结果显示, 青霉素致痫后大脑皮层神经元胞浆内可见大量的棕黄色颗粒沉积，Caspases?3表达较强。而D组腹腔注射不同剂量的TMP, 大脑皮层大脑皮层神经元胞浆内可见较少的棕黄色颗粒，Caspases?3表达较弱； 特别是腹腔注射TMP40mg·kg-1, 大脑皮层神经元胞浆内可见少量的棕黄色颗粒，Caspases?3表达非常弱。实验结果表明， TMP抑制大鼠癫痫样放电的机制可通过抑制大脑皮层神经元的凋亡而使大脑皮层神经元结构和功能恢复正常。TMP在体内吸收后,能有效地透过血脑屏障,并广泛分布于大脑皮层、脑干、纹状体、海马、小脑和中脑等部位。TMP在体内有广泛的抑制效应, 具有抑制缺血、抗再灌注所致心律失常的作用, 并有抑制心肌耗氧量的作用。TMP在大脑皮层缺血所致海马神经元坏死的过程中起着重要的保护作用。
【】
1 胡祁生, 汤剑青, 魏劲波, 等. 川芎嗪对吗啡依赖大鼠戒断综合征的抑制作用.药物依赖性杂志, 1999, 8 (4) : 270～ 271.
2 NI JW , Mtsumo to K, Watanabe H. Tetram thylpyrazine improves spatial cogruitive impairment induced by permanent occlusion of bilateral common carotid arteries or socpolamine in rats.Jpn J Pharmaco l, 1995, 67 (2) : 137～ 141.
3 Luo XX, Ogata H, et al. Protective effects of tetramethylpyrazine on ischemic neuroal damage in the qerbil h ippocampns. NO ToShinkei, 1994, 46(9):841～ 846.
4 扬光田, 李树生, 邓普珍. 实验动物复苏及缺氧时川芎嗪对心脑的作用.中国急救医学,1997,17(1): 71.
5 韩丹, 张桂林. 实验性大鼠癫痫模型异常脑电波及物理特征. 中国医学物杂志,1998,15(2):85～ 87.
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7 Grullich C, Sullards MC, Fuks Z, et al. CD95 (Fas/APO?1) signals ceramide generation independent of the effector stage of apoptosis. J Biol Chem， 2000, 275(12): 8650～8656.
8 Harvey NL, Kumar S. The role of caspases in apoptosis. Adv Biochem Eng Biotechnol, 1998, 62: 107～128.
9 Golstein P. Controlling cell death. Science, 1997, 275(5303): 1081～1082.
