正交投影鉴别决明子色谱指纹图谱峰纯度

                 作者：方洪壮　沈德凤 任淑清

【关键词】  正交

　　摘要：应用正交投影法对色谱指纹图谱的峰进行鉴别。用对照组分光谱与目标色谱峰前后的零浓度区光谱构建正交投影阵，对目标色谱峰的光谱进行投影，以投影前后光谱的夹角余弦作为判据来鉴别目标色谱峰的峰纯度。对决明子药材色谱指纹图谱的峰纯度鉴别，识别出大黄素、大黄素甲醚及大黄酚三个纯色谱峰。正交投影鉴别色谱指纹图谱峰的纯度方法结果可靠，背景的干扰可消除。

　　关键词：正交投影；色谱指纹图谱；色谱峰纯度；决明子                           
　　准确识别色谱峰的纯度是色谱的定性和定量分析的前提。由于中药的化学成分多为次生代谢产物，彼此间的化学结构差别很小、理化性质近似，其色谱峰在色谱指纹图谱上不可避免有重叠，准确判别色谱峰纯度更显重要。鉴别色谱指纹图谱色谱峰的纯度、确认色谱峰不仅增加指纹图谱的信息量，而且有助于对中药的深入研究。色谱峰纯度的定性可归结为仪器方法和化学计量学方法［1］，其中后一方法又是前一方法的基础。本研究根据正交投影的原理和多组分色谱相关光谱的方法［2，3］，应用正交投影法对中药决明子药材的色谱指纹图谱中的色谱峰进行了纯度鉴别，识别出三种蒽醌类成分的纯色谱峰。实验结果显示，所提出的方法结果可靠，有一定的实用价值。

　　1 方法原理

　　设X为采用联用色谱测得的中药色谱指纹图谱的N×M 阶二维数据矩阵,它们的行方向表征了色谱的流出信息（M个流出时间点）,列方向表征了光谱信息（N 个吸收波长）；用Xa表示X中的待鉴别的目标组分色谱峰的N×m 阶二维数据矩阵，考虑到仪器的背景，可把矩阵Xa分成两个部分，即：Xa＝ Xb＋Xc(1)Xc表示来自目标组分的主要信息，而Xb则表示来自仪器的背景。在目标色谱峰前后的零浓度区内分别各选取一点s（目标色谱峰前）与e（目标色谱峰后），以此两点的光谱矢量Bs和Be及对照组分的光谱失量Bc，组成光谱矩阵A：A=［Bs, Be, Bc］(2)并构造正交投影阵：M＝I－AA+(3)其中, I 为单位矩阵，A+为A的广义逆阵。用矩阵M 对Xc沿色谱方向的每一光谱矢量xcj进行投影运算：xcj*＝ M xcj(4) xcj表示Xc的第j 条光谱, xcj*表示xcj投影后的残余光谱。为消除不等性噪声［4］的影响，令投影后所得的残余光谱xcj*与投影前的原始光谱xcj的夹角余弦为rj，即：
rj = xcj*xcjT/(‖xcj*‖‖xcjT‖) [JY〗(5)
并以rj作为鉴别色谱峰纯度的判据［3］。

　　由于M扣除了xcj与A 相关的光谱信息， xcj*保留了xcj与A 不相关的光谱信息，所以，rj值越小,即经投影所得的残余光谱xcj* 与投影前的原始光谱xcj的夹角越大，说明xcj*保留xcj的光谱信息越少，xcj与A 相关性越大；反之rj 值越大,说明xcj*保留xcj的光谱信息越多, xcj与A 的光谱相关性越小。当rj 值等于0 时, xcj*与xcj完全正交, M 完全扣除了xcj与A 相关的光谱信息, xcj*完全只剩下随机噪声。 以投影矩阵M 对指纹图谱X中的目标色谱峰Xc的每一列光谱进行投影，可得沿色谱方向的光谱残差夹角余弦曲线， 若该曲线目标色谱峰时间范围的rj 值为零或接近于零，则说明它所对应的目标色谱峰为一与对照组分相同的单一物质峰，否则，目标色谱峰为一重叠峰。

　　2 实验部分

　　21  仪器与试剂

　　HP1100高效液相色谱仪，包括Agilent1100四元泵，HP1100二极管阵列检测器，HP色谱化学工作站。决明子药材（河北）；大黄素、大黄素甲醚、大黄酚对照品均购自药品生物制品检定所。乙腈、甲醇为色谱纯，盐酸、磷酸及氯仿为分析纯。

　　22  样品制备

　　221 对照品溶液            

　　称取大黄素、大黄素甲醚、大黄酚对照品适量，以甲醇为溶剂，配制成200 μg/ml的大黄素、大黄素甲醚、大黄酚三种成分的混合对照品溶液。

　　222 供试品溶液             

　　取决明子样品，粉碎，过80目筛，称取2g，加1.5mol/L的盐酸溶液30ml，加热回流1.5h，放冷，加氯仿25ml，回流20min,取出，分取氯仿层，酸水层再加氯仿25ml，回流20min，分取氯仿层，同上法操作，加氯仿再回流提取2次，合并4次氯仿提取液，加水20ml振摇洗脱，弃去水层，将氯仿液蒸干，残渣加甲醇微热使溶解，定量转移10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。放置，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤。

　　23 色谱条件

　　色谱柱：Hypersil ODS(4.0mm×250mm,5μm),保护柱：Scienhome C18柱(3.0mm×20mm,5μm)；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液(B)作梯度洗脱，0 min，5%A-95%B；10 min，15%A-85%B；20 min，35%A-65%B；55 min，70%A-30%B；56 min后100%A；流速：1.0ml/min；柱温：室温；检测波长：278nm；参比波长：340nm；光谱数据记录范围：220～500nm，波长间隔2nm；进样量：10μl。

　　24  目标峰确定

　　取决明子供试品溶液按选定色谱条件测定,记录其色谱图，结果见图1。另取大黄素、大黄素甲醚、大黄酚对照品混合溶液同法测定。比较对照品与决明子图谱，并利用色谱工作站峰判定功能，初步确定图1中的8、9、10号峰分别为大黄素、大黄酚、大黄素甲醚目标峰。

　　25 色谱峰纯度鉴别

　　分别于大黄素、大黄素甲醚、大黄酚对照品混合溶液的各色谱峰处采集色谱光谱二维数据，并在供试品溶液色谱8，9，10号峰前后的零组分区采集色谱光谱二维数据，按（3）式分别构造各对照品的正交投影阵，以投影矩阵对指纹图谱中相对应的图谱片断的每一列光谱进行投影，并按（5）式目标色谱峰的光谱正交投影前后光谱失量的夹角余弦。由计算结果可知图1中的8、9、10号峰分别为大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的色谱纯峰。

　　3 结果与讨论

　　31 目标色谱峰的背景的影响

　　试验中发现目标色谱峰的峰前与色谱峰后的二维数据背景对色谱峰纯度的鉴别均有影响，对于色谱指纹图谱中的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰纯度的鉴别，如光谱矩阵A中不包括Bs 和 Be，即不考虑对背景进行扣除，均难以得到确定的结果。以10号峰大黄素甲醚为例，正交投影前后光谱失量的夹角余弦曲线图（图2）表明，对背景干扰进行扣除后可准确地识别。这是由于中药成分的复杂性及色谱的流出时间较长，在中药色谱指纹图谱的测定中不可避免地存在着仪器的背景，如不进行二维数据的背景扣除，必将对色谱峰纯度产生误判。

　　32 不等性噪声影响

　　实验表明，对目标色谱峰的光谱进行投影后，得到的残余光谱并非为零或接近于零，而残余光谱与投影前的光谱余弦值近似为零。图3 为在相应色谱保留时间内的大黄素甲醚残余光谱模的曲线及相应的残余光谱与投影前的光谱余弦值曲线，从图3中可知，两者相差很大。实验所鉴别的大黄素与大黄酚的计算呈现了类似的结果。这是由于，当无干扰存在时，若指纹图谱X中目标色谱峰与对照组分为同一物质, 对其对应的光谱经投影运算后,所得残余光谱xcj*应为 0 矢量,对其求模后应为零,即‖xcj*‖值等于零。但是,由于实际的量测体系受噪声等因素的影响, 尤其是不等性噪声影响，使得投影光谱矢量不可能为零。而以残余光谱与投影前的原始光谱的夹角余弦为鉴别指标，可消除不等性噪声的影响。

　　1 黄方，康继宏，郁建，等. 色谱峰纯度的定性方法. 色谱，1995，13(1)：34

　　2 Lorber A. Error propagation and figures of merit for quantification by solving matrix equations. Anal Chem, 1988, 58：1167

　　3 胡芸，梁逸曾，李博岩，等. 多组分光谱相关色谱极其在中药色谱图谱分析中的应用.化学学报，2003，61（9）：1466

　　4 Keller H R, Massart D L, Liang Y Z, et al. Effects of scan time on methods based on evolving factor analysis in liquid chromatography. Analytical Chimica Acta, 1992,25：125