原位杂交检测NF

            作者：吴建红　张端莲　陕光 陕声国

【关键词】  血管瘤；核转录因子；

　　摘要：目的： 探讨NFκB p65在血管瘤发生、及退化过程中的表达状况及其意义。方法： 采用免疫组织化学方法（SP法）和原位杂交的方法，检测人皮肤血管瘤增生期、退化期及正常皮肤组织及内皮中NFκB p65的表达水平，并利用机图像分析技术测量不同时期血管瘤组织和正常皮肤组织NFκB p65表达的平均光密度和平均阳性面积。结果：增生期血管瘤内皮细胞NFκB p65表达水平高于退化期，差异有显著性(P＜0.01)；退化期血管瘤内皮细胞NFκB p65表达水平与正常皮肤组织相比，差异无显著性(P＞0.05)。结论： NFκB p65可能通过调控血管生成因子的表达而促进血管瘤的形成。

    关键词：血管瘤；核转录因子；

　　血管生成因子皮肤血管瘤是婴幼儿常见的良性肿瘤，是以毛细血管内皮细胞增生为主要特征。在血管瘤发生和发展的过程中，血管生成被公认为是其关键环节。在众多血管生成因子中，已证明TGFβ、TNFα、IL1α、IL8、ICAM1等含有NFκB的特异性结合位点，其表达受NFκB的调控，而这其中的一些因子，例如TGFβ、ICAM1等，已被证实与血管瘤的病理演变过程有关。为此我们应用免疫组织化学和原位杂交的方法检测了同时期人皮肤血管瘤组织中以及正常皮肤组织中NFκB p65蛋白的表达，以探讨NFκB p65在血管瘤发生、发展过程中的作用机制。

    1材料与方法

    11材料

    111材料来源收集武汉大学人民病理科1996~2001年皮肤血管瘤存档蜡块49例。其中男性26例，女性23例；最小年龄2月，最大年龄68岁，平均年龄30.3岁。这些血管瘤所在的部位有头皮、前额、眼睑、耳背、颈部、背部、上臂、大腿、手和足的皮肤等。患者术前均未做任何辅助性。

    112材料分组蜡块切片厚5 μm，常规HE染色和免疫组织化学SP法检测增殖细胞核抗原（PCNA，proliferating cell nuclear antigen），按Mulliken分类标准并结合PCNA的表达进行分组。增生期血管瘤27例，退化期血管瘤22例，另取瘤组织周围正常皮肤组织5例作对照。

    12试剂与仪器

    121主要试剂NFκB p65mRNA原位杂交检测试剂盒；浓缩型鼠抗人NFκB p65单克隆抗体；即用型鼠抗人PCNA单克隆抗体；即用型兔抗人第Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体；即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒；DAB显色试剂盒及多聚赖氨酸。

    122主要仪器YWY781型医用微波仪(250 W，50 Hz)；家用高压锅。

    13方法

    131常规HE染色。

    132免疫组织化学SP法检测PCNA和第Ⅷ因子相关抗原及NFκB p65主要步骤：5 μm 组织切片常规脱蜡至水，3%过氧化氢处理10 min以抑制内源性过氧化物酶活性， PCNA、NFκB p65采用高压抗原修复，第Ⅷ因子相关抗原采用胃酶消化修复抗原，正常羊血清处理10 min以减少非特异性背景，一抗(NFκB，1: 200) 37 ℃孵育1 h，生物素标记的二抗处理10 min，链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物处理10 min，DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，作为NFκB p65的阳性对照组，人正常皮肤组织中的血管内皮细胞作为PCNA的阳性对照组。

    133原位杂交检测NFκB p65mRNA的表达主要步骤：组织切片常规脱蜡至水，3%H2O2室温处理10min以灭活内源性过氧化物酶。切片上滴加胃蛋白酶，37℃消化25min。按每张切片加20μl含寡核苷酸探针的原位杂交液，37℃恒温过夜进行杂交。洗脱后滴加封闭液37℃，20 min。滴加SAHRP37℃处理20 min。DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替含寡核苷酸探针的原位杂交液作为阴性对照组，人扁桃体作为阳性对照组。

    14结果判断

    141PCNA和第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学结果判断PCNA以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性反应，第Ⅷ因子相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝外，应无棕黄色反应物。

    142NFκB p65免疫组织化学结果判断NFκB p65以胞核和胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应，阴性对照组除细胞核染成蓝外，应无棕黄色反应物。采用HPIAS1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对NFκB p65mRNA的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个高倍镜视野（×400),测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例５个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

    143NFκB p65mRNA原位杂交检测结果判断细胞膜或胞浆呈蓝色为NFκB p65mRNA阳性，阴性对照组除细胞核染成蓝色外，应无蓝色反应物。定量分析方法同上。

    15统计学处理

    对各组NFκB p65免疫组织化学及原位杂交化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和q 检验，检验水准α为0.05。

    2结果

    21HE染色

    增生期血管瘤组织中可见条索状或片状内皮细胞增生，其间有不规则的内皮间隙和完整的血管腔，内皮细胞核肥大而淡染。退化期血管瘤组织中可见内皮细胞减少，血管腔增大，血管间结缔组织增多，内皮细胞核扁平。

    22PCNA的表达

    增生期血管瘤内皮细胞核肥大，核内弥漫分布棕黄色颗粒，PCNA表达强；退化期血管瘤内皮细胞核扁平，大多数细胞核被苏木精染成蓝色，少数胞核内有少量棕黄色颗粒，PCNA弱表达。

    23第Ⅷ因子相关抗原的表达

    增生期和退化期血管瘤内皮细胞胞浆内弥漫分布棕黄色颗粒。

    24NFκB p65的表达

    增生期血管瘤内皮细胞胞浆和部分内皮细胞胞核内有较多棕黄色颗粒，NFκB p65表达强；退化期血管瘤内皮细胞胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积，胞核内无棕黄色颗粒沉积，NFκB p65表达极弱或无表达；正常皮肤组织血管内皮细胞胞浆内有少许或无棕黄色颗粒沉积，胞核内无棕黄色颗粒沉积，NFκB p65表达极弱或无表达。经单因素方差分析，各组间的差异有显著性意义(P＜0.05) 。经q 检验，增生期组与退化期组、增生期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P＜0.01) ；退化期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P＞0.05)。见表1。表1血管瘤不同时期NFκB p65表达的平均光密度和阳性面积率

    25原位杂交检测NFκB p65mRNA的表达

    增生期血管瘤内皮细胞胞膜和胞浆有较密集蓝色颗粒；退化期血管瘤内皮细胞胞膜和胞浆内无蓝色颗粒沉积；正常皮肤组织血管内皮细胞胞膜和胞浆无蓝色颗粒沉积。图像分析结果显示：增生期血管瘤NFκB p65mRNA表达的平均光密度为0.1563化期血管瘤表达NFκB p65mRNA的平均光密度为0.0617，正常皮肤组织NFκB p65mRNA表达的平均光密度为0.0516；增生期血管瘤表达的NFκB p65mRNA阳性面积率为0.2881，退化期血管瘤NFκB p65mRNA表达的阳性面积率为0.1250，正常皮肤组织NFκB p65mRNA表达的阳性面积率为0.1289。经单因素方差分析，增生期组与退化期组，正常皮肤组与增生期组的差异有显著性意义（P＜0.05)。经q检验，退化期组与增生期组、增生期组与正常皮肤组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义（P＜0.05)。退化期组与正常皮肤组差异无显著性意义。见表2。表2血管瘤不同时期NFκB p65mRNA表达的平均光密度和阳性面积

　　3讨论

    血管瘤是一种良性肿瘤，内皮细胞过度增殖和凋亡、血管迅速生长是血管瘤病理组织学的最大特点。近年来研究表明［1~2］，血管内皮细胞的增殖和血管形成（angiogenesis）在血管瘤病理演变过程中起重要作用。体外组织培养实验证实血管瘤的血管内皮细胞比正常组织内的血管内皮细胞更易生长，还能摄取 3  H胸苷,并可见到血管形成现象，提示血管瘤是一种血管形成性疾病［3］。目前，有关血管瘤形成过程中血管内皮细胞过度增殖的研究报道较少。核转录因子NFκB是1986年由美国麻省理工学院癌症研究中心的Baltimore和麻省Whitehead生物医学研究所的Sen［4］在成熟B细胞和浆细胞中发现的这种能与免疫球蛋白κ轻链轻链基因的增强子κB序列（5'GGGACTTTCC3'）特异结合蛋白，并能促进κ轻链基因的表达，并将其命名为NFκB（Nuclear factor of kappa B）。后来的研究发现，NFκB是由各种同源和异源NFκB/Rel蛋白质亚基组成的二聚体，正常情况下，NFκB/Rel二聚体与抑制性蛋白质IκB的亚基结合形成三聚体，以无活性形式存在于胞浆内［5～7］。许多因素例如IL1、TNFα、LPS、病毒感染、双链RNA和PKC的激活等均可活化NFκB，NFκB被活化后，IκB从NFκB复合体上脱落，IκB迅速被分解，活化的NFκB进入细胞核，与细胞核内特定的靶基因的结构域结合，引起相应基因的转录。

    本实验采用免疫组织化学方法对NFκB p65在49例人血管瘤组织中的表达进行了检测，并结合PCNA的表达对血管瘤进行比较准确的分期。另外由于血管瘤组织中细胞成分较多，本实验通过检测第Ⅷ因子相关抗原的表达证实了血管瘤组织中表达NFκB p65的细胞是内皮细胞。实验结果表明，增生期血管瘤内皮细胞胞浆和胞核均有不同程度NFκB p65表达，退化期血管瘤组织和正常皮肤组织中NFκB p65主要表达于内皮细胞胞浆中。而且增生期血管瘤NFκB p65表达水平高于退化期，差异有显著性(P＜0.01)；退化期血管瘤NFκB p65表达水平与正常皮肤组织相比，差异无显著性(P＞0.05)。NFκB p65在血管瘤增生期的表达处于较高水平，而在血管瘤的退化期，NFκB p65的表达降低。国外有研究发现，用NFκB反义核苷酸能够抑制TNFα诱导的血管生成，同时能抑制TNFα介导的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，提示NFκB对bFGF和VEGF的表达也存在潜在的调节作用。故推测，处于增生期的血管瘤组织中NFκB p65处于活化的状态，从而促进血管内皮细胞的增殖以及血管瘤的形成。

    1Pollman MJ, Naumovski L,Gibbons GH,et al. Vascular cell apoptosis :cell typespecific modulation by transforming growth factorbetal in endothelial cell versus smooth muscle cell. circulation,2001,91(15):2019

    2Jang YC, Isik FF, Gibran NS.Nerve distribution in hemangiomas depends on the proliferative state of the microvasculature.J Surg Res,2000,93(1):144

    3宋天宝,邱东.实用免疫组织化学技术. 第一版.陕西技术出版社,1994，241.

    4Sen R, Baltimore D. Multiple nuclear interact with the immunoglobulin enhancer sequences. Cell, 1986, 46:705716

    5石缨. 细胞内信号传递与转录调控的研究进展. 国外医学.分子生物学分册, 1997,19(5) : 201

    6Natoli G, Costanzo A, MorettiP, et al. Nuclear factor κBindepenent cytoprotective pathways originating at tumor necrosis factor receptorassociated factor 2. J Biol Chem, 1998, 173(47): 31262

    7Perera L, Waldmann TA. Activation of human monocytes induces differential resistance to apoptosis with rapid down regulation of caspase8/FLICE. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 95(24): 14308~14313.