糖尿病大鼠心肌组织中bcl
【关键词】 糖尿病；,,心肌细胞；,,bcl
摘要： 目的：探讨糖尿病大鼠心肌组织中bcl2的表达及对心肌细胞凋亡的影响。方法：按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(10只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度>16.6mmol/ L、饮水量>40 ml/d 、尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。将糖尿病模型组和对照组大鼠处死,切取心室肌组织,进行组织切片和免疫组织化学实验观察。结果：糖尿病模型组心肌细胞Bcl2表达的平均光密度及阳性面积率与对照组心肌细胞比较有显著性差异（P＜0.01)。结论：糖尿病导致的心肌病与心肌细胞凋亡等有关。
关键词： 糖尿病； 心肌细胞； bcl2； 细胞凋亡
糖尿病性心肌病是糖尿病的慢性并发症之一,是糖尿病发病过程中特异性的心肌受损和心脏功能改变,糖尿病性心肌病的出现可以不伴有缺血性病变、血管病变及高血压等并发症。目前糖尿病性心肌病的确切病因还不清楚,但目前认为糖尿病性心肌病的发生主要与心肌能量代谢紊乱、Ca2+超载、血管动脉硬化、氧化应激、高血压及高血糖导致的心肌细胞凋亡等有关。本研究采用免疫组织化学方法，研究了糖尿病心肌组织中bcl2 及bax 蛋白表达情况，旨在探讨糖尿病所致心肌细胞凋亡现象。
1 材料与方法
11 材料
昆明种SD大鼠20只,雄性,体重180～200g,由武汉大学医学院实验动物中心提供,适应饲养1周后进行实验。
12 方法
121 糖尿病模型制备及分组 按体重随机分为正常对照组(10只)和实验组(10只) ,各组大鼠禁食12h 后,实验组大鼠以60mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ溶液(用0.1mol/ L、pH = 4.4 的构橼酸盐缓冲液在冰浴下配制成11mg/ml的STZ 溶液),正常对照组大鼠(NC)注射等体积的枸橼酸盐缓冲液。观察动物饮水、进食及尿量变化等情况。一周后,采尾血测血糖,以血糖浓度> 16.6mmol/ L 、饮水量>40 ml/ d 、尿糖强阳性( + + + ～ + + + + )的大鼠作为糖尿病大鼠。将糖尿病模型组和对照组大鼠处死,切取心室肌组织,进行组织切片和免疫组织化学实验观察。
122 主要试剂和仪器 浓缩型鼠抗人Bcl2单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新公司）；DAB显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。YWY781型医用微波仪(浙江临安器材厂生产)；家用高压锅。
123 方法 免疫组织化学SP法检测Bcl2抗原，其主要步骤如下：① 组织切片5 μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③ Bcl2采用微波抗原修复（3档，10 min）， PBS洗4×5min；④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；⑤ 一抗（Bcl2，1:50 )37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。
用PBS代替一抗作为阴性对照组，人扁桃体作为Bcl2阳性对照组。
124 免疫组织化学结果判断 ① Bcl2相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。② 采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对Bcl2的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400)，测定每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。
125 统计学处理 对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNKq检验，检验水准α为0.05。
2 结果
对照组心肌细胞胞浆内可见较多棕黄色颗粒，糖尿病模型组心肌细胞胞浆内无棕黄色颗粒沉积。图像分析结果显示：对照组心肌细胞Bcl2表达的平均光密度为0.1535， 糖尿病模型组心肌细胞Bcl2表达的平均光密度为0.0594；对照组心肌细胞Bcl2表达的阳性面积率为0.2589，糖尿病模型组Bcl2表达的阳性面积率为0.1363。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01)。经q 检验，糖尿病模型组与对照组之间，Bcl2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异（P＜0.01)，见表1。
表1（略）
注：* 糖尿病模型组与对照组比较， P＜0.01。
3 讨论
糖尿病是目前临床学科中进展最迅速的学科之一。糖尿病患者在及世界范围内均呈迅速增多的趋势,目前全世界有糖尿病患者1.125 亿,我国糖尿病的患病率为2.51%［1~5］。糖尿病患病率最高地区为新疆自治区克拉玛依市, 其次是北京地区。据报道，西藏糖尿病的患病率也呈上升趋势。重度糖尿病及合并多脏器严重病变的患者尤为困难,若不积极防治,常常需截肢而致残,甚至导致死亡。因此防止糖尿病越来越引起广大医护人员及患者的关注。糖尿病是一组由于多种原因引起的胰岛素分泌缺陷,或胰岛素作用缺陷,或两者兼而有之引起的以高血糖为特征的代谢疾病。胰岛素是由胰腺中β细胞分泌的,是葡萄糖代谢中不可缺少的一种激素。当胰岛素分泌不足,葡萄糖利用及贮存受阻,血液中葡萄糖浓度(血糖浓度) 就会升高。血糖浓度超过一定水平,多余的葡萄糖便通过肾脏排出体外,这时化验小便会发现尿糖阳性,故称糖尿病。糖尿病的基本特征是长期高血糖,慢性高血糖可引起多脏器的长期损害、功能减退和衰竭，尤其是眼、肾脏、神经、心脏和血管［6~8］。病情严重或应激时可发生急性代谢紊乱,例如:糖尿病酮症酸中毒、糖尿病高渗性昏迷等。随着,人民生活水平不断提高,老龄化社会的到来,糖尿病(diabetes mellitus ,DM) 在中老年人群中的发生率日益增高。DM 及其并发症对患者的健康和生命造成严重威胁,甚至导致残废和死亡。
血管病变是糖尿病主要慢性并发症, 其中大血管病变是糖尿病死亡的主要原因。 Cai 等［9］ 研究发现,高血糖可直接导致活体心肌细胞凋亡,高血糖导致的心肌细胞凋亡至少部分是通过细胞色素C 激活的caspase3 途径的激活而控制。Cai等报道在糖尿病患者和动物模型中都可观察到心肌细胞死亡,通过抗氧化剂或凋亡信号途径的特异性抑制剂抑制心肌细胞死亡,可以明显的阻止糖尿病的心脏毒性,因此心肌细胞死亡在糖尿病性心肌病变中有重要作用。bcl2 原癌基因家族是一组存在于线粒体膜及核膜的蛋白质,与细胞凋亡关系密切,其中bcl2 高表达可抑制凋亡，bax 则为促凋亡因子。当触发因素存在时,bcl2与bax 的比值决定着细胞是存活或是死亡。本研究结果显示，与对照组比较,心肌中促凋亡因子bax 的表达增加,而抑凋亡因子bcl2的表达略有下降，同时发生心肌细胞凋亡现象，提示凋亡相关基因可能参与调控心肌损伤过程。
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