当归注射液对缺血再灌注损伤心肌细胞组织化学变化的影响

【关键词】  当归注射液；,,缺血再灌注；,,心肌；,,组织化学

　　摘  要：  目的：探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。方法:将45只SD大鼠随机分成3组(每组n=15) :假手术组(Ⅰ组)，缺血再灌注组(Ⅱ组)，当归组(Ⅲ组) ,建立在体心肌缺血再灌注动物模型。实验完毕后，将各组动物心肌组织做组织化学染色，观察各组动物心肌细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)活性。利用HPIAS2000图像分析系统测定SDH在以上3组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：当归治疗组心肌细胞中SDH反应物呈颗粒状,均匀分布于肌膜下或肌丝区之间, 颗粒呈深紫色, 表示酶活性很强；假手术组酶反应物呈浅紫色细小颗粒状，肌膜下或肌丝区之间可见少量的紫色颗粒，分布较稀疏，表示酶活性较弱；缺血再灌注损伤组SDH反应物极弱，几乎未见酶活性表达。图像分析结果显示当归治疗组与假手术组和缺血再灌注损伤组之间平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；假手术组与缺血再灌注损伤组之间平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。结论：当归注射液对大鼠缺血再灌注损伤心肌细胞有重要的保护作用。

　　关键词：  当归注射液；  缺血再灌注；  心肌；  组织化学   

　　自1977年Hearse首次提出缺血再灌注损伤概念以来，已逐渐引起医学界的高度重视。大量动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。缺血再灌注损伤对心肌组织的结构和功能的影响一直是研究的重点之一。当归的药用价值早已为人们所认识, 从当归的乙醇提取物中分离到6种化合物分别为: (E)藁本内酯, (Z)藁本内酯, (Z)正丁基呋内酯, 棕榈酸, B2谷甾醇, 阿魏酸。此外还含有蔗糖、多种氨基酸及微量金属元素、烟酸、丁二酸、腺嘌呤、尿嘧啶、胆碱等成分。当归的药理作用主要是：①促进机体免疫；②对呼吸系统的作用；③对血液循环系统的作用，有报道［1］。 当归对冠心病患者应用当归注射液治疗能平衡和抑制血小板聚集的作用，因而能明显改善胸痛、胸闷等临床症状和心电图缺血性STT 的变化, 是治疗冠心病的有效药物［2］。当归具有钙通道阻滞作用, 拮抗钙超载, 对心肌缺血再灌注所致心肌损伤有保护作用。在缺血及再灌注状态下, 心脏顺应性及射血功能得到良好的保护, 使反映心肌损伤程度的CPK 活性和氧自由基损伤过程产生的过氧化脂质分解产物MDA 的浓度大大降低［3］。但当归对缺血再灌注损伤心肌细胞结构的影响，目前国内外未见报道。本研究采用组织化学方法，并利用HPIAS2000图像分析系统测定SDH在以上3组中表达的平均光密度和平均阳性面积率，探讨当归抗心肌缺血再灌注损伤保护作用的机理。

　　1  材料与方法

　　11  动物模型制备及分组健康雄性SD大鼠（SPF级）45只,体重250～300 g 左右，由武汉大学医学院动物试验中心提供。腹腔注射戊巴比妥钠4.5 mg・(100 g)-1 ,麻醉动物后行气管切开接微型呼吸机人工呼吸［呼吸频率60 次・min-1 ,潮气量2ml・(100g)-1,微型呼吸机由第二军医大学生产］ ,沿胸骨左缘第4 肋骨开胸在左心室、右心室与左心房交界处结扎/ 开放左冠状动脉前降支建立心肌缺血再灌注模型。将动物随机分成3组(每组n = 15):假手术组(Ⅰ组) ,丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎；缺血再灌注组( Ⅱ组) ,缺血再灌注前5min 腹腔注射生理盐水0. 8 ml・(100 g)；当归治疗组( Ⅲ组),缺血再灌注前5min 腹腔注射当归注射液0.8 ml・( 100g)-1 。每组5只动物缺血30min再灌注40min ,10只动物缺血30min 再灌注120min。在缺血再灌注开始前, 经舌静脉注射伊文氏蓝, 缺血40min后心尖无蓝色且呈乌红部分为缺血区,再灌注120min 后心肌经TTC处理后心尖为白色部分为梗死区。

　　12  主要试剂25%当归注射液由武汉大学中南制药厂提供,批号为970118。

　　13  标本制作及观察用Nachlas硝基四氮唑蓝法显示琥珀酸脱氢酶(SDH)活性。以上各组动物实验完毕后,将各组动物从心底部剪取心脏,切下心室。新鲜组织恒冷式切片，片厚10μm。① 入孵育液中，370C，15~60分钟    孵育液配法：0.2M磷酸缓冲液（pH7.6）   1份            0.2M的琥珀酸溶液        1份            NitroBT水溶液          2份② 生理盐水稍洗；③ 10%甲醛盐水固定10分钟；④ 15%酒精稍洗1分钟；⑤ 生理盐水稍洗；⑥ 甘油明胶封片。

　　14  图像分析采用HPLAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对酶活性表达进行定量分析,每张切片随机选取5个高倍镜视野(×400),测定SDH每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积,阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值。

　　15  统计学处理用SPSS11.5软件对各组组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和ＳＮＫ(q)检验,检验水准α为0.05。

　　2  结果

　　21  光镜观察假手术组可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，但可见部分胞浆溶解。缺血再灌注损伤组见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，胞浆溶解呈空泡或网状，细胞界限模糊，可见心肌细胞断裂。当归组可见心肌细胞呈短圆柱状，有分支，细胞核呈椭圆形位于中央，胞浆内可见平行排列的肌原纤维，细胞轮廓清晰。

　　22  组织化学观察 琥珀酸脱氢酶(SDH) 活性当归治疗组心肌细胞中SDH反应物呈颗粒状,均匀分布于肌膜下或胞浆内, 颗粒呈深紫色, 表示酶活性很强。假手术组肌酶反应物呈浅紫色细小颗粒状，可见少量的紫色颗粒，分布较稀疏，表示酶活性较弱。缺血再灌注损伤组SDH反应物极弱，几乎未见酶活性表达，表示无酶活性表达。经单因素方差分析,各组间的差异有显著性意义(P<0.05)，见表1。

　　表1  当归注射液对大鼠缺血/再灌注损伤心肌细胞内SDH活性影响的平均光密度和阳性面积率(略)
　
　　经SNK(ｑ)检验, 当归治疗组与假手术组和缺血再灌注损伤组之间SDH 活性的平均光密度及阳性面积率分别为：当归治疗组平均光密度0.4625±0.0875；假手术组平均光密度0.2684±0.0076；缺血再灌注损伤组平均光密度0.2471±0.0021。当归治疗组阳性面积率0.4448±0.0918；  假手术组阳性面积率0.1963±0.0824；缺血再灌注损伤组阳性面积率0.1841±0.0679。当归治疗组与假手术组比较平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；当归治疗组与缺血再灌注损伤组比较平均光密度及阳性面积率的差异有显著性意义(P<0.01)；假手术组与缺血再灌注损伤组之间比较平均光密度及阳性面积率的差异无显著性意义(P>0 05)。

　　3  讨论

　　局部组织或器官缺血将导致组织或器官的损害，但随着血供恢复，在随后的一定时间内组织或器官的损伤不仅不会减轻，反而逐渐加重，此即所谓的缺血再灌注损伤（ischemic reperfusion injury,IRI）。自1977年Hearse首次提出缺血再灌注损伤概念以来，已逐渐引起医学界的高度重视。大量动物实验显示，氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞、细胞黏附分子和细胞凋亡等均可能参与再灌注损伤的发病过程。目前虽然对缺血或缺血再灌注损伤的确切机制还不十分清楚,但已经知道损伤的临床结局主要就是细胞死亡。细胞死亡有两种形式:一种是坏死,另一种是凋亡。凋亡(apoptosis) 是细胞在基因调控下的主动性死亡,不引起炎症反应。持续缺血和缺血再灌注时心肌组织都可发生细胞凋亡。已经证实,人类心肌梗死除细胞坏死外,细胞凋亡也参与了梗死的病理过程,细胞凋亡不仅影响梗死面积,而且促成心脏结构的重构,心肌梗死的早期和晚期均存在凋亡现象［4］。再灌注损伤引起的细胞凋亡多分布于短暂缺血后血管再通的相关部位和梗死灶的收缩带区域。有资料显示,心肌梗死急性期的存活心肌其Bcl2 表达增加,而慢性期Bax表达增加,说明刺激因子由Bcl2和Bax 基因产物来抑制或诱导存活的心肌细胞凋亡［5］。细胞凋亡的基因调控是一个十分复杂的问题,尤其是相关基因的相互关系尚不十分清楚。缺血再灌注损伤对心肌组织的结构和功能的影响一直是研究的重点之一。当归为伞形科植物当归Angelicasinennsis(Oliv.)Diels的干燥根，味甘、辛,性温。当归能显著延缓肌肉萎缩,增加肌肉组织SOD的含量,其机理可能与当归促进肌肉血液循环、改善代谢有关。研究发现,应用当归注射液对更年期大鼠进行静脉连续给药20天后,血SOD活性明显增高,脂质过氧化物(LPO)水平下降,说明当归注射液可清除氧自由基,抗脂质过氧化物反应,对更年期大鼠心血管系统有重要的保护作用［6，7］。本实验通过结扎/松解左冠状动脉前降支复制心肌缺血再灌注模型，并用当归注射液预处理，结果显示当归治疗组心肌结构正常，未受到破坏和影响，且心肌酶的活性很强。心肌细胞内线粒体含量丰富，构成细胞容积的35%~40%，含有大量催化三羧酸（TCAC）、氨基酸代谢、脂肪酸分解、传递以及能量转换的酶和辅酶，LDH 、SDH则是其中的两种酶。心肌脱氢酶学改变是心肌损害的早期有意义的指征，缺血心肌脱氢酶的缺失是不可逆性心肌损害的明确指标［8］。我们的实验也已证明了这一点。因此通过实验表明：当归注射液预处理提高了心肌酶的活性并维持了细胞超微结构的完整性，对缺血再灌注心肌细胞有保护作用。从以上的实验结果和讨论来分析当归注射液为防治缺血再灌注损伤的应用具有重要的研究意义，并且为加强心肌保护作用提供重要的理论依据。

　　参  考  文  献

　　1  戴瑞鸿,李勇,范维琥，等. 保护内皮细胞功能在防治心血管疾病中的重要性. 国际心血管杂志,2000 ,2 (4) : 328

　　2  谢志泉. 细胞凋亡与缺血性心脏病. 心血管病学进展,1999 ,20(5) :279

　　3  Olivetti G,Abbi R ,Quaini F， et alApoptosis in the failing humanheart.N Eng J Med ,1997,336:1131

　　4  Kehl F,Pagel PS,Krolikowski JG,et al.Is Isofluraneinduced Preconditioning Dose Related. Anesthesiology,2002,96(3):675~680

　　5  Li F,Hayes JK,Wong KC, et al. Administration of sevoflurance prior to prolonged global ischemia improves heart function in isolated rat heart. Acta Anaesthesiologica Sinica,2000,38(1):113~121

　　6  魏蕾,欧阳静萍,王雄,等.当归对高分子右旋糖酐诱导人红细胞聚集性增强的影响.微循环学杂志,2001,11(1):30~31.

　　7  陆红,周大兴,严建伟,等.不同产地当归对凝血功能影响垢对比实验研究. 浙江中医学院学报,2002,26(6):48~49.

　　8  袁新初,张端莲.当归注射液对更年期大鼠超氧化物歧化酶和脂质过氧化物的影响. 中草药,2001,32(9):822~823.