核转录因子κB与脑缺血再灌注损伤

【关键词】  脑缺血

　　NFkappa B and cerebral ischemia reperfusion   
　　脑缺血再灌注损伤（CIRI）是由兴奋性（氨基酸）中毒、氧化应激、细胞内钙超载、炎症反应和细胞凋亡（AP）等多种因素参与的病理过程［1］。以往对CIRI机制的研究主要集中在氧化应激、兴奋性（氨基酸）中毒、细胞内钙超载等方面，近年来随着分子生物学的，发现CIRI与炎症反应和细胞凋亡也有着密切的关系。CIRI中炎症细胞和炎症分子起了关键的作用，而可以调节多种炎症分子转录并能引起靶基因表达增加的核转录因子κB（NFκB）起着重要的调控作用。同时CIRI后细胞凋亡的发生又是一个由基因调节的细胞主动死亡过程，多种基因产物的主动表达在CIRI后细胞凋亡的发生过程中起保护或损伤作用；另外，NFκB作为前凋亡因子或抗凋亡因子以不同的组合形式与某些凋亡相关基因结合对CIRI又有着不同的影响。

　　1  NFκB的生物学特性

　　1.1  NFκB的结构特点NFκB属于Rel蛋白家族，是由两种Rel家族亚基：RelA（p65）、RelB、cRel和NFκB1（p50/p105）、NFκB2（p52）中任意两种NFκB／Rel蛋白亚单位构成的二聚体蛋白质，这些蛋白质均具有能与DNA结合的特性，又称DNA结合亚单位，其中发挥主要生理功能的是p50与p65构成的二聚体蛋白质。当细胞处于静止状态时，NFκB与其抑制蛋白（Inhibitory Kappa B，IκB）以非活性的配体结合存在于胞浆中而没有活性。

　　1.2  NFκB的活化信号目前已发现多种因素可以诱导NFκB的活化，主要包括：（1）外源性因素，包括紫外线、电离辐射、细胞毒性药物、微生物病原体及脂多糖等。（2）内源性因素，包括细胞因子（肿瘤坏死因子α、IL1、淋巴毒素）、炎症介质（血小板活化因子、白三烯、活性氧簇）、生长因子（IL2、巨噬细胞集落刺激因子、血小板衍生的生长因子）、免疫相关受体（CD3、CD18、TCR等）及氧化应激等。中枢神经系统内的NFκB活化信号可分两类：第一类与上述活化信号类似；第二类为中枢神经系统特异的NFκB活化信号，如去极化、神经递质、神经生长因子及一些神经毒素刺激等。

　　1.3  NFκB的激活途径NFκB的激活途径主要为：（1）在大多数细胞中，NFκB二聚体与IκB结合成三聚体。IκB覆盖于NFκB的核定位信号区（nuclear localization sequence，NLS），使之以无活性形式存在于胞浆中。细胞受到活化信号刺激后，由活化信号诱导激活的IκB激酶（IκB Kinase，IκK）引起IκBα蛋白第32和36位丝氨酸的磷酸化，磷酸化的IκBα 则由泛素蛋白在多个位点形成泛素化。最后，泛素化的IκBα被26S蛋白酶水解降解，暴露出Rel蛋白上的NlS，这样就使NFκB快速易位进入核内，与DNA特定序列结合，引起靶基因表达增加［2］。（2）在细胞核内水平，通过p65亚单位磷酸化引起NFκB结构改变而调节NFκB的转录活性。（3）NFκB的不典型激活途径，即IκK独立的激活途径。

　　1.4  NFκB的靶基因NFκB诱导表达的靶基因有：（1）细胞因子，包括TNFa、IL1、IL2、IL3、IL6、IL8、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子；（2）粘附分子，包括血管细胞粘附分子1（VCAM1）、细胞间粘附分子1（ICAM1）、内皮细胞白细胞粘附分子1（IIAM1）；（3）急性期蛋白，如C反应蛋白（CRP）、血管紧张素；（4）受体，包括MHC1、血小板激活因子受体、组织因子（TF）、免疫球蛋白κ轻链；（5）酶，如COX2（可诱导环氧化酶2）、线粒体抗氧化酶；（6）趋化因子，如单核细胞趋化因子1、MIP、MCP；（7）参与细胞循环及凋亡的蛋白，包括cmyc、p53、Rb、TRAF1（TRADDTNFRassociated factor 1）、TRAF2、凋亡抑制蛋白（tAPs 如cIAP1 cIAP2）、抗凋亡的Bcl2蛋白家族成员；（8）其他如可诱导一氧化氮合酶（NOS）。对神经元有保护作用的有：tAPs、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）以及抗凋亡的Bcl2蛋白家族成员、粘附分子ICAM1、NOS等［3］。

　　1.5  NFκB的活化反馈调节NFκB活化反馈调节有两种途径：（1）经细胞外的正反馈途径。NFκB活化后可增强TNFα和IL1的基因转录，使其产生和释放增多，进而再次激活NFκB；NFκB活化后还可使IL6和IL8产生和释放增多，导致最初的炎症信号进一步放大。（2）经细胞内外的负反馈途径。在细胞内，NFκB活化后，在启动炎症介质基因转录的同时，IκBα和p105的基因转录增强。这些抑制成分的增多有助于将NFκB限制在细胞质中，使活化的NFκB活性下调，终止细胞因子基因的转录，并限制急性炎症反应。此外，NFκB的活化，使p50同源二聚体生产增多，此种二聚体不能被IκB有效结合，并缺乏转录激活区，易位至细胞核后，可与NFκB竞争性结合κB序列，抑制NFκB的活性。在细胞外，LPS、肿瘤坏死因子α（TNFα）和IL1能刺激反向调节细胞因子IL10的产生，后者能阻断单核细胞中内毒素诱导的NFκB的活化，抑制细胞因子的产生，限制急性炎症反应。正负反馈两种调节方式往往是同时进行的，至于NFκB的活化状态则取决于何种调节占优势。

　　2  NFκB和CIRINF

　　κB广泛存在于神经系统中，包括脑血管内皮细胞、神经细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。许多研究证实CIRI后有NFκB表达的增加。Shen等［4］应用大鼠全脑缺血再灌注（GCIRI）模型，缺血30 min于6～12 h后发现海马区NFκB活性较对照组增高10倍。Stephenson等［5］发现在鼠大脑中动脉闭塞2 h，再灌注后2 h、6 h和12 h脑缺血灶中NFκB的活性进行性的增加，在缺血区皮质和纹状体中有p50和p65的表达。Williams等［6］发现在再灌注后24 h缺血区大脑半球的神经元、神经胶质细胞、血管上皮细胞以及浸润的淋巴细胞中有很强的NFκB表达。Numi A等［7］在人脑卒中死亡后23 h、28 h和38 h尸检脑梗死灶中观察到23 h神经元胞浆中有很强的NFκB活性表达，28 h在细胞浆和细胞核中均检测到NFκB的活性，38 h只有细胞核中有中等量的NFκB表达，证实了人类脑卒中后1～2 d NFκB被激活并转移至神经元细胞核中。NFκB活性增高后对脑具有保护作用还是损伤作用目前仍存在异议。Crack PJ［8］等认为NFκB对脑具有保护作用还是损伤作用，主要取决于NFκB产生部位、刺激物（活化信号）、产生量和持续时间等。Clemens等［9］用四管堵塞法（4vessel occlusion）造成鼠前脑缺血30 min再灌注24 h后发现NFκB在前脑神经元中只有短时间的活性增高，而72 h在海马CAI区凋亡的神经元中仍有NFκB活性表达，因此认为再灌注24 h后NFκB可能诱导神经元中保护因子的产生，而再灌注72 h海马区神经元NFκB活性持续表达可诱导CAI神经元死亡蛋白的产生。Domanskajanik K等［10］在研究海马不同区域神经元时发现，缺血3 h NFκB活性增高，缺血3～4 d，海马CAI区锥形细胞可见DNA断裂片断。Nurmi A等［7］发现在持续性局灶性脑缺血中NFκB能促进脑梗塞的形成。Stephenson［11］等用有神经保护作用的抗氧化剂LY341122减低NFκB的激活，使再灌注后DNA片段减少，梗死面积缩小；Wang YH等［12］发现黄衫素可通过其抗氧化作用，进而调节NFκB的活化而减轻脑缺血再灌注损伤进而间接证明了NFκB有神经损害作用。

　　3  Bcl2、Bax与CIRICIRI

　　中以神经元为主的细胞凋亡是其重要的病理生理过程。Bcl2基因家族是与细胞凋亡密切相关的基因，Bc12和Bax分别是Bc12家族中最具代表性的抑制凋亡蛋白和促进凋亡蛋白，二者的比值决定细胞的存活与凋亡。Bax可与Bcl2蛋白形成异源二聚体或自身形成同源二聚体。当Bax蛋白受到凋亡刺激因素作用后，由胞质向线粒体外膜转位，与膜上电压依赖性离子通道结合，使之激活，形成同源二聚体，并促使凋亡相关蛋白如细胞色素C、caspase酶原等从线粒体间隙释放入胞质中，执行凋亡程序。但随着Bcl2蛋白表达量的上升，Bcl2可通过与Bax竞争性结合，使越来越多的Bax同源二聚体分开，与Bc12形成比BaxBax更稳定的BaxBc12异源二聚体，“中和”了BaxBax诱导凋亡的作用即封闭了Bax形成孔道的活性，阻止细胞色素C等穿过线粒体膜进入细胞质，避免凋亡启动复合物的形成，从而抑制细胞凋亡［13］。通常，含少量Bax的细胞只需低水平的Bc12即可达到形成BaxBc12异源二聚体的严格化学剂量，从而终止凋亡的发生。因此，BaxBc12异源二聚体形成的调节是细胞凋亡调控中一个非常重要的环节。然而，也有研究提示，Bcl2和Bax可独立地调节凋亡。因为，无Bax存在时，Bc12仍可抑制凋亡；无Bc12存在时，Bax也能够促进凋亡；而且，Bax缺乏与Bcl2表达可产生协同效应影响凋亡。余涓等［14］用线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）2 h/再灌注24 h模型，用TTC染色观察脑梗死面积，TUNEL法检测神经细胞凋亡，免疫组化法检测脑组织Bcl2和Bax蛋白表达，结果损伤侧脑组织出现明显的梗死灶，神经细胞凋亡率与Bax蛋白表达均明显升高，Bcl2/Bax比值明显下降。王新高等［15］也用同样的方法检测到大鼠颈动脉闭塞90 min/再灌注48 h模型梗死灶中Bcl2/Bax比值明显下降，并设想通过上调Bcl2/Bax来实现保护线粒体，对抗细胞凋亡，进而对抗CIRI。Xia CF等［16］将人类组织激肽释放酶基因于鼠MCAO后移入鼠脑组织，经过观察发现在CIRI中激肽释放酶可通过调节B2激肽受体，提高大脑NO及Bcl2的水平，降低过氧化物的产生和Bax的水平来抑制细胞凋亡和炎症反应，促进血管和神经再生。Amemiya S［17］等在用依达拉奉（自由基清除药）对抗CIRI的实验中发现该药是通过调节Bcl2/Bax依赖的抗凋亡机制来发挥神经保护作用的。

　　4  NFκB与Bcl2、BaxBcl2

　　基因家族包括Bclxshort、Bcl2、Bclxlong、Bad、Bak、Bax等，其中Bcl2、Bclxlong具有抑制凋亡的作用，Bclxshort、Bad、Bak、Bax则有促进凋亡的作用。Dixion等［18］在研究中发现，Bclx基因5’启动子区存在NFκB结合一致性序列NFκB/CS4，而Bcl2家族其他成员在前5个调控区中也包含NFκB/CS4一致性序列。海马CA1区NFκB于缺血72 h被持续激活，致使Bclx转录活性增强，因而Bclxshort增多，后者将促进细胞的凋亡过程。Qiu J等［19］进一步研究认为，在全脑缺血后可形成cRel/p50和p50/p50两种二聚体形式，两者均可结合至海马区神经元细胞Bclx基因启动子的NFκB/CS4序列上，而只有p50/p50可以与前脑底部神经元细胞的Bclx基因启动子的NFκB/CS4序列相结合。不同组合形式的NFκB二聚体对缺血有不同的反应，这是NFκB在CIRI缺血缺氧过程中对Bclx基因表达的组织特异性调控的过程有所不同所致；同时，NFκB对凋亡细胞所起的作用还与组织细胞的类型、特征、刺激持续时间、频率及二聚体的活性度有关［19，20］。NFκB的激活增加缺血神经元细胞的死亡，但其作用在不同类型细胞各不相同，小胶质细胞的NFκB的激活促进了缺血神经元的变性，而神经元的NFκB的激活可增加其卒中后的存活率［21］。目前认为NFκB既为细胞生存因子即抗凋亡因子存在，也作为前凋亡因子存在。在TNFα激活引起细胞凋亡信号传导机制中NFκB的激活起了重要的抗凋亡作用。抑制NFκB活性可明显增加神经元细胞对TNFα诱导凋亡的敏感性［22］，说明NFκB具有抗凋亡作用。这一结果也被Hill WD等［23］证实，他们观察了NFκB抑制剂DDTC对短暂MCAO后DNA断裂和脑梗塞面积的影响，结果发现：DDTC组DNA断裂较对照组明显增多，同时脑梗塞面积也增大，间接说明NFκB具有抗凋亡作用。NFκB激活后引起的抗凋亡机制是由于上调了抗凋亡基因的表达，抗凋亡基因包括TRAF1、TRAF2、cIAP1、cIAP2等，它们是NFκB转录活性的靶基因与抵抗TNF介导的凋亡有关。Urnowey S等［24］在研究龈拟杆菌对成人口腔的感染及牙龈组织的破坏时，观察到感染2～12 h，NFκB激活，同时伴随其诱导的细胞抗凋亡基因Bfl1、Boo、BclXL、Bcl2、Mcl1、Bclw及存活素（Survivin）的表达，此时NFκB起抗凋亡因子的作用。当感染24～36 h，NFκB的活性仍有强的表达，但上述抗凋亡基因表达减少，前凋亡基因Nip3、Hrk、Bak、Bik、Bok、Bax、Bad、Bim和Moap1被激活，促进细胞凋亡，故此时NFκB充当前凋亡因子。

　　5  结语

　　CIRI病理过程机制复杂，NFκB只是其中的一个方面，虽然国内外学者进行了大量的实验研究和理论探索并取得了显著的进步，但NFκB在其中的作用机制和途径还不是很清楚，仍有待于进一步研究和探索。

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