昂丹司琼对切口痛模型大鼠自发痛行为及脊髓背角c?Fos表达的影响

【摘要】  目的：研究昂丹司琼局部应用对切口痛模型大鼠自发痛行为及脊髓背角c?Fos表达的影响。方法：大鼠随机分为生理盐水对照组（n=8），利多卡因20 mg/mL组（n=8），昂丹司琼32 mg/mL组（n=8）和假手术组（单纯乙醚麻醉组）（n=8）。通过三点阻滞法分别给予实验药物，15 min后建立切口痛模型，计数其后1 h内大鼠的累积痛评分，并于2 h后取大鼠相应节段脊髓标本，通过免疫组化方法检测脊髓c?Fos的表达情况。结果：与盐水对照组相比，利多卡因组和昂丹司琼组大鼠的累积痛评分均明显下降，其脊髓c?Fos表达也被明显抑制。结论：局部应用昂丹司琼对切口痛模型大鼠自发痛行为及脊髓背角c?Fos表达均有明显的抑制作用。

【关键词】  昂丹司琼；c?Fos；疼痛

5?羟色胺?3(5?HT3)受体阻滞剂昂丹司琼自问世以来一直作为一种有效的中枢镇吐剂应用于临床，在疼痛方面的研究近来才刚起步，有报道其在疼痛的中起到了一定的作用。本实验以大鼠慢性切口痛模型来验证昂丹司琼是否具有抗伤害作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料

　　1.1.1  实验动物 

　　选择健康雄性SD大鼠共32只（由大坪野战外科研究所动物房提供），体重200～300 g。

　　1.1.2  实验试剂 

　　昂丹司琼纯制剂（山东齐鲁制药有限公司）。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  动物分组及方法 

　　大鼠随机分为盐水对照组，利多卡因20 mg/mL组，昂丹司琼32 mg/mL组和假手术组（单纯乙醚麻醉组），每组8只。

　　1.2.3  疼痛模型的制备 

　　将大鼠左后爪消毒，按照Brennan［1］法从足底近端0.5 cm处向趾部作长约1 cm的切口，用眼科镊挑起足底肌肉并纵向切割，钝性分离，保持肌肉的起止及附着完整。按压止血用5?0细线缝合皮肤。手术过程约为5 min。

　　1.2.4  神经冲动阻滞（三点阻滞法） 

　　生理盐水对照组、利多卡因组、昂丹司琼组参照［2］选择三点注射的方法，包括了局部神经阻滞及局部的浸润麻醉。乙醚麻醉下，大鼠踝关节后部的中点和侧面分别注射相应药液0.1 mL，阻滞其腓肠神经和胫神经。随后在要做切口的足跖部皮下局部浸润相应药液0.3 mL。15 min后，行切口痛模型的制作。假手术组给予单纯乙醚麻醉不行神经冲动阻滞。

　　1.2.5  累积痛评分

　　参照Brennan法［1］待大鼠清醒后观察后爪着地及负重情况，后爪被压迫发白表示负重。后爪翘起不着地，计2分；后爪着地但不负重，计1分；后爪着地并且负重，计0分。每5 min观察1次，每次1 min，以1 min内最常采取的姿势为标准，共观察1 h （共记分0～24分）。以术侧足评分减去对侧足评分即为所得累积疼痛评分。

　　1.2.6  Fos免疫组织化学方法 

　　各组大鼠均于创伤后120 min，在戊巴比妥钠深麻醉下开胸，自左心室插管至升主动脉。先以150 mL生理盐水快速冲去血液，再以含4%多聚甲醛的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）400 mL进行组织灌注固定，持续0.5～1 h。取出脊髓，以腰膨大为标志，截取L 3?5节段，移入含30%葡萄糖的4%多聚甲醛中固定至沉底。冰冻冠状连续切片，片厚35 μm。切片以PBS液漂洗10 min/次，共3次，再以0.3%Triton?X100漂洗30 min。ABC免疫组化染色。

　　1.3  统计学分析

    计量资料以均数±标准差（±s）表示，使用SPSS 11.0统计软件，组间采用单因素方差分析。P<0.05差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  累积痛评分

    与生理盐水对照组相比，其余三组的累积痛评分均明显降低（P<0.01），说明利多卡因与昂丹司琼均能明显降低大鼠切口痛模型后的自发痛程度，昂丹司琼组与利多卡因组相比差异无统计学意义（P>0.05）。假手术组累积痛评分趋近于0，说明单纯的乙醚麻醉不会对大鼠的自发痛行为造成明显的影响，见表1。表1  累积痛评分比较
生理盐水组假手术组利多卡因组昂丹司琼组累积痛评分（略）注：*与盐水组相比，P<0.01；＃与假手术相比，P<0.01；△与利多卡因组相比，P<0.01

　　2.2  FLI记数

    在显微镜下(×100)观察大鼠患侧脊髓内出现Fos活性特征(胞核有黄色颗粒)的细胞，根据Rexed分层法记数脊髓背角各板层中Fos阳性细胞(FLI)的数目。脊髓背角Ⅰ、Ⅱ层FLI计数各组分别为：生理盐水组58±4（图1，图2）；昂丹司琼组29±4（图3，图4）；利多卡因组24±5（图5，图6）；假手术组5±2（图7，图8）。与生理盐水组相比，其余三组的FLI计数均明显降低（P<0.01），说明利多卡因与昂丹司琼均能明显的降低大鼠切口痛模型后的脊髓背角c?Fos的表达，昂丹司琼组与利多卡因组相比差异无统计学意义（P>0.05）。假手术组脊髓背角c?Fos几乎没有表达，说明单纯的乙醚麻醉不会对大鼠的脊髓背角c?Fos的表达造成明显的影响，见表2。表2  各组术侧背角FLI阳性神经元数目比较（略）

　　3  讨论

    c?Fos是众多即刻早期基因之一，多种因素刺激均可诱导c?Fos活化，迅速一过性表达Fos，并进一步诱导靶基因表达，介导其他缓慢的效应。因此，大鼠腰段脊髓背角Fos蛋白是评价药物阻滞麻醉效果的理想指标。
   
　　昂丹司琼作为一种高选择性的5?HT3受体阻滞剂，自问世以来一直作为一种有效的中枢镇吐剂应用于临床。近来昂丹司琼在疼痛方面的作用逐渐受到重视。在对异丙酚静脉注射痛的临床研究中发现，昂丹司琼能有效的减轻这种疼痛［2，3］。Muller W等［4］研究了局部应用昂丹司琼来治疗肌踺炎、外周关节炎、肌盘膜痛等肌病，发现局部注射昂丹司琼的镇痛作用与局部注射利多卡因类似，而这种作用所持续的时间较利多卡因更长。有研究报道单次静脉注射昂丹司琼对临床神经病理性疼痛有很好的疗效。然而有关昂丹司琼的这种抗伤害作用并不能单纯用对5?HT3受体的阻滞来解释。Ye JH等［5］应用膜片钳技术发现昂丹司琼对钠通道呈现明显浓度相关性的阻滞效应，而钠通道阻滞是局部麻醉药的特性，推测昂丹司琼的抗伤害作用可能还与钠通道阻滞有关。
   
　　以往研究疼痛多在化学、炎症刺激等疼痛模型中进行，但皮下注射福尔马林或其他致炎剂所产生的组织损伤和疼痛，无论是疼痛产生的机制，还是疼痛过程都与病人术后切口疼痛存在着明显不同。Brennan等［1］在1996年建立了一种新的术后疼痛模型，它是通过对大鼠后爪足底的皮肤、筋膜及深部组织（肌肉）的切割来模拟病人术后疼痛。实施此手术的大鼠表现自发性疼痛行为、机械性异常疼痛、机械性痛觉过敏和热痛觉过敏，这些疼痛行为和持续时间与临床上外科手术和术后状态基本一致。研究发现施行这种手术的大鼠能表现出自发性疼痛行为、机械性触诱发痛和热痛觉过敏，在大鼠后爪手术后大约30 min手术侧后爪就出现机械性疼痛表现，2 h达到峰值，持续4～7 d，而非手术侧却不受影响。其疼痛行为和持续时间与临床上手术和术后疼痛状态有相似之处。因此，本实验采用了此种疼痛模型。

    本实验采用了三点阻滞法来阻断切口痛模型的疼痛信号传入。Pogatzki EM等［6］于2002年首次报道了三点阻滞法在大鼠切口痛模型的应用，即为了完全阻滞大鼠足跖部切口神经冲动的传入，采用了局部神经阻滞及局部的浸润麻醉。在切口痛模型制作前15 min，于大鼠踝关节后部的中点和侧面分别注射0.5%的布比卡因0.1 mL，阻滞其腓肠神经和胫神经。随后在要做切口的足跖部皮下局部浸润布比卡因0.3 mL。注射后的4 h内，观察到大鼠的痛行为学反应明显减轻，同时脊髓背角WDR神经元的单位放电频率的增幅也较单纯切口痛模型组明显减少，而盐水对照组则没有此现象，说明了这种阻滞方法的有效性。Xiaohui S等［7］也已证实了，在制作切口痛模型前通过三点阻滞法给予局部麻醉剂布比卡因和利多卡因，均能明显的减少1 h后大鼠脊髓后角浅层Fos的表达。
   
　　钠通道阻滞剂如局部麻醉药应用后能抑制外周神经的动作电位的产生及幅度，从而降低向中枢神经系统传入的冲动，起到止痛的目的。昂丹司琼因被证实有钠通道的阻滞作用，因此，本文通过局部给药的方式，并与局部麻醉药对照，观察昂丹司琼局部应用是否能通过其对钠通道的阻滞作用，降低动作电位的发生频率和幅度，从而达到降低切口痛模型伤害性刺激传入的强度，达到镇痛的目的。本实验的结果证实，在痛行为学的评定数据比较中，利多卡因与昂丹司琼均能明显的降低大鼠切口痛模型后的自发痛程度，且昂丹司琼组与利多卡因组相比没有显著的差异。同样，利多卡因与昂丹司琼均能明显的降低大鼠切口痛模型后的脊髓背角c?Fos的表达，并且昂丹司琼组与利多卡因组相比也没有显著的差异。这说明提前局部注射昂丹司琼能象局麻药利多卡因一样降低因切口痛模型所引起的伤害性刺激的传入，并且两者的效果在本实验中没有发现明显的区别。
  
　　本实验在动物模型上验证了昂丹司琼对急性切口痛模型的伤害性刺激传入的阻断作用，为昂丹司琼在疼痛治疗中的应用提供了一定的依据。同时以昂丹司琼为代表的5?HT3受体阻滞剂或与之结构类似的药物因其对5?HT3受体和钠离子通道的双重阻滞作用，可作为一种新型局部麻醉药物的研究方向，为开发出全新意义的局部麻醉剂提供思路。

【】
  ［1］Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. Characterization of a rat model of incisional pain ［J］. Pain, 1996, 64: 493?501.

　　［2］Gregory RE, Ettinger DS. 5?HT3 receptor antagonists for the prevention chemotherapy?induced nausea and vomiting: a comparison of their pharmacology and clinical efficacy ［J］. Drugs, 1998, 55: 173?189.

　　［3］Reddy MS, Chen FG, Ng HP. Effect of ondansetron pretreatment on pain after rocuronium and propofol injection: a randomised, double?blind controlled comparison with lidocaine ［J］. Anaesthesia, 2001, 56: 902?905

　　［4］Muller W, Stratz T. 5?HT3 receptor?antagonists in therapy of rheumatic diseases ［J］. Z Rheumatol, 2003, 62: 39?41.

　　［5］Ye JH, Mui WC, Ren J, et al. Ondansetron exhibits the properties of a local anesthetic ［J］. Anesth Analg, 2004, 85: 1116?1121.

　　［6］Pogatzki EM, Vandermeulen EP, Brennan TJ. Effect of plantar local anesthetic injection on dorsal horn neuron antivity and pain behaviors caused by incision ［J］. Pain, 2002, 97: 151?161.

　　［7］Xiaohui S, Masataka Y, Satoshi M, et al. The effect of pretrement with lidocaine or bupivacain on the spatial and temporal expression of c?Fos protein in the spinal cord caused by plantar incision in the rat ［J］. Anesth Analg, 2004, 98: 1093?1098.