蛤蚧乙醇提取液对大鼠卵巢颗粒细胞影响的实验研究

【摘要】  目的：研究蛤蚧乙醇提取液对大鼠卵巢颗粒细胞的影响。方法：3月龄和6月龄的Wister雌性大鼠各20只，随机分为实验组和对照组各10只；实验组大鼠给予蛤蚧乙醇提取液灌胃，对照组大鼠给予生理盐水灌胃。15 d后取卵巢做免疫荧光；分别用激光共聚焦显微镜检测IGF?1、inhibin?а(Inh A)并测各组的荧光强度值。结果：实验组与对照组比较IGF?1、InhA，均有升高，差异有统计学意义，对照组IGF?1的表达６月龄组高于３月龄组（P<0.05），Inh A的表达在实验组和对照组中６月龄组均高于３月龄组（P<0.01）。结论：蛤蚧乙醇提取液能显著提高IGF?1和Inh A在大鼠卵巢中的表达，从而改善大鼠卵巢功能，促进优势卵泡和黄体的发育。

【关键词】  蛤蚧；卵巢；大鼠

蛤蚧是壁虎科动物Gekko gecko的干燥体。全年均可捕捉，除其内脏拭净，用竹片撑开使全体扁平顺直，低温干燥。主产于广西、云南、贵州等地，味咸性平，归肺、肾经，具有补肺益肾、纳气定喘、助阳益精功效，用于虚喘气促、劳嗽咳血、阳痿遗精。肝脏分泌的胰岛素样生长因子（IGF?1）能刺激颗粒细胞DNA的合成，促进卵泡发育，并能有效抑制体外预排卵卵泡颗粒细胞凋亡的发生。颗粒细胞分泌的抑制素（inhibin）的含量在衰老的卵巢中明显减少。因此，抑制素被公认为是衡量卵巢贮备能力、卵巢衰老的理想指标［1］。本课题从影响卵巢功能的局部调节因素着手，通过研究大鼠不同年龄阶段卵巢细胞生长因子IGF?1、抑制素（inhibin）含量的变化，探讨卵巢衰老及蛤蚧抗卵巢衰老作用的机制，从而寻求延缓和卵巢衰老的新方法、新途径。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料
      
　　Wistar大鼠（由重庆医科大学动物中心提供）；兔抗鼠IGF?1多抗购于武汉博士德公司，鼠抗人inhibin?а、兔抗鼠N?Cadherin多抗、FITC?羊抗兔IgG、TRITC?羊抗鼠IgG等均购于北京中山生物技术公司。激光共聚焦显微镜由重庆医科大学基础医学研究所提供（Leica sp?2，德国）。

　　1.2  蛤蚧乙醇提取液的制备

    将干品蛤蚧体60 ℃烘干后打成粉末，60%乙醇浸泡7 d后过滤去残渣，滤液用旋转蒸馏器蒸馏去除乙醇达饱和后置于4 ℃冰箱备用，每毫升蛤蚧乙醇提取液含蛤蚧原药0.25 g。

　　1.3  动物分组

    取Wister大鼠3月龄［平均体重（180±11）g］和6月龄［平均体重（230±13）g］各20只，随机分为实验组和对照组，每组各10只。实验组按原生药2 g/(kg·d)剂量灌胃，共15 d，对照组相同体积生理盐水灌胃，共15 d。

　　1.4  标本制备

    于末次灌胃后24 h处死大鼠，采集卵巢标本；按常规制备大鼠卵巢的石蜡标本并切片备用。

　　1.5  免疫荧光标本的制备

    取各组的大鼠卵巢石蜡切片常规脱腊至水。冷PBS漂洗2 min × 3 次，加封闭羊血清20 μL，10 min后倾去羊血清不洗。各组分别滴加一抗：兔多抗IGF?1（1∶50），鼠抗人inhibin_а，荧光空白对照组用PBS代替，4℃湿盒内孵育过夜。冷PBS漂洗2 min × 3 次，兔多抗IGF?1（1∶50）组滴加二抗：FITC?羊抗兔F（ab）（1∶50）；鼠抗人inhibin_а组滴加TRITC?羊抗鼠IgG；37 ℃湿盒内孵育45 min。冷PBS漂洗2 min × 3 次，50％缓冲甘油封固，在激光共聚焦显微镜下观察。FITC标记的IGF?1显现黄绿色荧光。TRITC标记的inhibin_а显现红色荧光。

　　1.6  观察和测定方法

    激光共聚焦显微镜观察标本并摄像存储，用激光共聚焦显微镜自身的图像分析系统测量并分析各组的平均荧光强度值。因FITC?羊抗兔F（ab）经抗原抗体识别反应特异地结合于IGF?1，因此荧光强度值能准确地表示IGF?1的相对数量。同样TRITC的荧光强度值则能准确地表示Inh A的相对数量。所有数据均为定量数据，结果采用t检验分析。

　　2  结果

　　2.1  大鼠卵巢IGF?1和Inh A平均荧光强度值

    经激光共聚焦显微镜观察并测量荧光强度值，然后各组平均荧光强度值。具体数值见表1。从表1的结果可以看出，蛤蚧醇提液能显著提高IGF?1在不同月龄（3月龄和6月龄）Wistar大鼠卵巢中的表达（P＜0.01），同时能显著提高Inh A在不同月龄（3月龄和6月龄）Wistar大鼠卵巢中的表达（P＜0.01），提示蛤蚧能改善大鼠卵巢的功能，促进优势卵泡和黄体的发育。从表1还可得知，对照组中6月龄组IGF?1和Inh A均显著高于3月龄组（P＜0.05和P＜0.01）。表1  大鼠卵巢IGF?1和Inh A平均荧光强度值检测结果（略）

　　2.2  大鼠卵巢IGF?1和Inh A表达的荧光图

    从图1中可以看出，实验组3月龄大鼠卵巢颗粒细胞IGF?1的表达较对照组显著增加，平均荧光强度值相比差异有统计学意义，见表1。在图2中，6月龄大鼠卵巢颗粒细胞IGF?1的表达，实验组较对照组显著增加。其平均荧光强度值分别为 85.52±9.54和57.87±6.48，差异有统计学意义。图3显示，实验组3月龄大鼠卵巢颗粒细胞Inh A的表达较对照组显著增加；具体数据见表1。在图4中，6月龄大鼠卵巢颗粒细胞Inh A的表达，实验组较对照组显著增加。其平均荧光强度值分别为94.98±7.65和 67.19±6.25，差异有统计学意义。

　　3  讨论

    研究表明，蛤蚧醇提物可使幼年雌小鼠子宫和卵巢增重，阴道开放时间提前，使去势雄性大鼠精囊和前列腺增重，且尾全蛤蚧组更明显［2］，蛤蚧尾的性激素样作用较蛤蚧体强，可能与蛤蚧尾锌含量较高有关。蛤蚧醇提物能缩短雄性果蝇交配潜伏期，延长交配时间，并能显著降低鼠血液中卵泡刺激素（FSH）浓度而显著提高血中雌二醇（E2）的浓度［3］。蛤蚧能明显改善鼠下丘脑?垂体?性腺轴功能，蛤蚧醇提物对雌性大鼠附性器官(子宫及阴道)主要为直接作用，但其完整作用须经卵巢、垂体及下丘脑［4］。

    IGF?1是肝脏合成的由70个氨基酸组成的多肽，其主要作用是通过与IGF?1受体（IGF?1R）结合，介导对生长激素（GH）的促进作用。IGF?1能促进生长中的卵泡和黄体产生血管内皮细胞生长因子（VEGF）［5］，而VEGF介导的血管发生对优势卵泡的选择和发育致关重要，如果阻断VEGF的活性，则该卵泡周期将被终止，重新开始新的卵泡募集阶段［6］。研究表明，卵巢的颗粒细胞存在IGF?1R，在优势卵泡的颗粒细胞中更为丰富［7］，IGF?1与受体结合后，能增强卵泡对FSH的反应性［8］，促进卵泡的发育。体外实验还证实IGF?1对鼠卵巢的颗粒细胞凋亡有抑制作用［9］。从表1的结果可以看出，蛤蚧醇提液能显著提高IGF?1在不同月龄（3月龄和6月龄）Wistar大鼠卵巢中的表达（P<0.01），从而促进卵泡的发育，并且有可能通过IGF?1抑制颗粒细胞的凋亡而减少卵泡的闭锁，由此进而延缓大鼠卵巢的衰老。

    抑制素是由卵巢颗粒细胞分泌的分子量为31～32 KDa的异二聚体糖蛋白激素，由α亚基及两种β亚基（βA和βB）之一通过二硫键连接而成，即Inh A（α?βA）和Inh B（α?βB），其主要生理作用是反馈性抑制垂体FSH的分泌。卵巢颗粒细胞分泌的抑制素的含量在衰老的卵巢中明显减少，因此抑制素（特别是Inh B）被公认为是衡量卵巢贮备能力、卵巢衰老的理想指标［1］。Inh B主要由中小窦状卵泡的颗粒细胞产生，可反应卵巢的储备能力，其分泌受FSH的调控。而Inh A主要由优势卵泡和黄体的颗粒细胞产生，可反映卵巢的功能，黄体生成激素（LH）对Inh A的分泌有促进作用［10］。卵泡膜细胞体外培养研究证实，Inh A通过增强LH与IGF?1诱导的雄烯二酮（E2的底物）的产生，从而对E2的合成起旁分泌作用。从表1的研究结果可知，蛤蚧醇提液灌畏大鼠能显著提高Inh A在不同月龄（3月龄和6月龄）Wistar大鼠卵巢中的表达（P<0.01），提示蛤蚧能改善大鼠卵巢的功能，促进优势卵泡和黄体的发育。这一结果提示蛤蚧可能会改善无排卵性功血、卵巢不排卵引起的不孕症及多囊卵巢综合征等患者的卵巢排卵功能，但尚需进一步的研究。

    从表1还可得知，对照组中6月龄组IGF?1和Inh A均显著高于3月龄组（P<0.05和P<0.01），说明大鼠卵巢中IGF?1和Inh A的表达与卵巢本身的功能状态有关，与青春前期（3月龄）相比，青春期（6月龄）大鼠卵巢功能明显活跃，卵泡开始发育，并可能有排卵和黄体形成，因而IGF?1和Inh A均显著升高。不同月龄实验组间IGF?1无显著差异（P>0.05），但6月龄组Inh A显著高于3月龄组（P<0.01），提示蛤蚧乙醇提取液虽能明显增加IGF?1和Inh A在大鼠卵巢的表达，但对不同功能状态的大鼠卵巢的作用强度是不同的。

【】
  ［1］Danforth DR, Arbogast LK, Mroueh J, et at. Dimeric inhibin: a direct marker of ovarian aging ［J］. Fertility and Sterility, 1998, 70(1): 119?123.

　　［2］胡绍兰, 袁喜保. 尾全蛤蚧与无尾蛤蚧体活性比较［J］. 北京中医, 1996, 5: 37?38.

　　［3］王荣琪, 沈稚芳, 薛长江, 等. 蛤蚧对大鼠性器官重量及生殖激素水平影响的初步观察［J］. 重庆医科大学学报, 1993, 18(1): 19?21.

　　［4］罗谋伦, 赵 一, 林启云. 蛤蚧雌激素样的作用部位实验研究［J］. 中成药, 1993, 15(5): 29?30.

　　［5］Martinez?Chequer JC, Stouffer RL, Hazzard TM, et al. Insulin?like growth factors?1 and ?2, but not hypoxia, synergize with gonadotropin hormone to promote vascular endothelial growth factor?A secretion by monkey ranulose cells from preovulatory follicles ［J］. Biology of Reproduction, 2003, 68(4): 1112?1118.

　　［6］Fraser HM, Wilson H, Rudge JS, et al. Single injections of vascular endothelial growth factor trap block ovulation in the macaque and produce a prolonged, dose?related suppression of ovarian function ［J］. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2005, 90(2): 1114?1122.

　　［7］El?Roeiy A, Chen X, Roberts VJ, et al. Expression of insulin?like growth factor?I (IGF?I) and IGF?II and the IGF?I, IGF?II, and insulin receptor genes and localization of the gene products in the human ovary［J］. Clin Endocrinol Metab, 1993,77: 1411?1418.

　　［8］Keay SD, Liversedge NH, Akande VA, et al. Serum IGF?1 concentrations following pituitary desensitization do not predict the ovarian response to gonadotrophin stimulation prior to IVF ［J］ . Human Reproduction, 2003, 18 (9): 1797?1801.

　　［9］Chun SY, Billig H, Tilly JL, et al. Gonadotropin suppression of apoptosis in cultured preovulatory follicles: mediatory role of endogenous insulin?like growth factor?I ［J］ . Endocrinology, 1994, 135: 1845?1853.

　　［10］Eldar?Geva T, Robertson DM, Cahir N, et al. Relationship between serum inhibin a and b and ovarian follicle development after a daily　fixed dose administration of recombinant follicle?stimulating hormone ［J］. Clin Endocrinol Metab, 2000, 85: 607?613.