肿瘤坏死因子-α对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3，MMP9和TIMP-2表达的影响
作者：吴琼，张德秀，李琛，齐翔云
【摘要】 目的：观察肿瘤坏死因子-α对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3，MMP9和TIMP-2表达的影响，探讨原发性开角型青光眼的发病机制。方法：对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养，应用免疫组化方法（NSE，Ⅷ因子相关抗原染色）鉴定细胞，化学及透射电镜对细胞进行形态学及生长特性的观察；对传3代的小梁细胞分别施加含TNF-α终浓度为0，12.5，25，50μg/L的培养液，48h后行MMP3和MMP9免疫组化SP染色，结果进行机图像分析并进行统计学检验。分组提取细胞培养液用ELASA检测TIMP-2量的变化。结果：体外培养的牛眼小梁细胞表达MMP3及MMP9，TNF-α可增加MMP3及MMP9的表达，并且抑制TIMP-2的表达。 结论：TNF-α在一定范围内可以增加MMP3及MMP9的表达（P＜0.05），并抑制TIMP-2的表达（P＜0.01），故TNF-α可以减少小梁细胞细胞外基质的堆积，使房水引流通畅，对激光小梁成形术的手术原理有一定的说明意义。
【关键词】 牛眼小梁细胞
0 引言
细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的异常堆积是原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma,POAG）小梁网组织的重要改变。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是一族降解ECM成分的含锌蛋白酶类，对于维持ECM不断产生与降解的动态平衡及正常的房水引流阻力具有重要意义。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）是一类重要的炎症因子，在激光小梁成形术后，眼内形成无菌性炎症生成TNF-α，而推测TNF-α就是通过调节MMP及其组织抑制物（tissue inhibitor,TIMP）的表达从而影响房水流出阻力。
1材料和方法
1.1材料 取附近屠宰场现杀新鲜牛眼，牛眼符合下列条件：①全部为小牛眼：牛龄小于24mo，以保证TMC培养的成活率；②剜取牛眼时如有眼球破裂及眼内炎症则全部废弃，以减少污染机会。将牛眼置于盛有冰袋的保温桶中迅速运回实验室。DMEM高糖培养基购自Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青公司，胰蛋白酶购自Sigma公司，EDTA购自Sigma公司，谷氨酰胺购自Sigma 公司。神经元特异性烯醇化酶（neuronal specific enolase，NSE）mAb、第Ⅷ因子相关抗原（factor Ⅷ related antigen，ⅧR:Ag）mAb、波形蛋白（vimentin）mAb均由西安大学第二病理科提供。MMP3，MMP9及TIMP-2mAb购自博士德试剂公司。SP免疫组化试剂盒购自华美试剂公司。ELASA试剂盒购自上海轩昊试剂公司，标准品和质控品均采用试剂盒中配套产品。试剂盒包括：酶标板1块，标准品1管，样品稀释液1瓶，浓缩洗涤液1瓶，抗TIMP-2抗体1瓶，HRP1瓶，TMB显色液和终止液各1瓶。
1.2方法 牛眼小梁细胞培养杨新光等[1,2]的方法。小梁细胞游离出组织块后，每周换液2次。待细胞长满瓶底后用1.25g/L的胰蛋白酶和0.2g/L EDTA消化传代。取传2代的小梁细胞接种于预置盖玻片的培养皿，待细胞贴壁2d后用0.01mol/L PBS 清洗3次，40g/L的多聚甲醛固定，行NSE、vimentin及ⅧR：Ag免疫组化染色。另取细胞铺片，用4℃预冷的20g/L戊二醛固定，送电镜室常规透射电镜标本制备。
1.2.1 MMP3和MMP9含量测定 取传3代的小梁细胞经消化离心后以5×107个/L的密度接种于预置盖玻片的6孔板中（每孔预置4张盖玻片），待细胞贴壁、基本长满盖玻片后，更换无血清培养基饥饿24h，24h后分别向各孔中施加TNF-α，使其终浓度分别为0（对照组）,12.5，25，50μg/L，24h后吸出细胞培养液,取出细胞爬片，0.01mol/L PBS冲洗3次,每次3min，用4g/L多聚甲醛固定，每一浓度组制备16张标本。对细胞爬片进行MMP3及MMP9 免疫组化SP法染色，染色结果在显微镜下观察并摄影。
1.2.2 TIMP-2含量测定 另取传3代的小梁细胞经消化离心后以5×107个/L的密度接种于24孔板和12孔板中，待细胞贴壁、基本长满孔底时，换用无血清培养基饥饿24h, 24h后分别加入TNF-α，使其在每孔中的终浓度分别为0（对照组），12.5，25，50μg/L，其中24孔板中每个浓度组6孔，12孔板中每个浓度组2孔。分别于12，24，36，48h时吸出24孔板中各浓度组细胞的培养上清，分装于EP管中，-20℃保存。12孔板中的细胞培养上清于24h后吸出，分装于EP管中，-20℃保存。在细胞上清收集充分后，解冻，离心，用ELASA试剂盒测其中TIMP-2的含量。建立标准曲线：设标准孔8孔，每孔中分别加入5μL不稀释的标准品，5μL 样本于反应板孔中。每孔中加入200μL Biotin anti TIMP-2，轻轻混匀30s。37℃温育30min。甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板，并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干），如此反复洗涤5次。每孔中加入200μL HRP,轻轻混匀10s，37℃温育30min。如上方法洗板。每孔中加入100μL TMB显色液，轻轻混匀10s，置暗处室温温育20min，每孔加入100μL终止液，轻轻混匀30s，15min内在450nm处读A值。各测定孔A值减空白对照孔（0μg/L）A值。以标准品0, 0.75，3，7.5，15，30μg/L之A值在半对数纸上作图以标准品浓度为横坐标，A值为纵坐标，画出标准曲线。根据每个测定样品的实际A值在该曲线图上查得各自含量（μg/L）。对MMP3及MMP9免疫组化染色结果进行计算机图像分析，高倍镜下随机选取视野，对细胞阳性信号进行灰度值测定，SPSS11.5进行统计分析。
2结果
2.1培养细胞的形态学观察 牛眼小梁细胞原代培养5～12d细胞从组织块向外生长。原代细胞形态不一，呈圆形、梭形、多角形，细胞轮廓清，折光性强。细胞核圆，核仁1～2个，胞质颗粒多。14d左右细胞围绕在组织块周围形成单细胞层。传代接种细胞数为4×107个/L，24h左右贴壁。传至3代的小梁细胞有稳定的形态结构，细胞胞质丰富，颗粒多，细胞可见胞突和分支。融合后细胞呈扁平上皮样，胞核卵圆形。由于原代牛眼小梁细胞对胰蛋白酶敏感，本实验中采用1.25g/L胰蛋白酶和0.2g/L EDTA消化细胞，并按1∶1对原代细胞传代，细胞生长良好。传1代细胞可按1∶2向后传代。透射电镜见细胞胞质丰富，富含核糖体、线粒体、高尔基复合体，有较多空泡，微丝于核膜周围可见，核膜双层，核周异染色质明显，核仁明显，可见双核仁。小梁细胞NSE染色阳性，vimentin染色阳性，Ⅷ∶Ag染色阴性，证实了小梁细胞的神经外胚层神经嵴间充质来源。结果与贺翔鸽等[3]相同。综上所述，从培养细胞的生长过程、形态学观察和免疫组化特性上证明，所培养的细胞是小梁细胞。
2.2 TNF-α对小梁细胞MMP3及MMP9表达的影响 免疫组化结果显示，对照组MMP3及MMP9染色均为阳性，阳性颗粒位于胞质，且核周浓集。表明传3代的牛眼小梁细胞表达MMP3及MMP9。TNF-α各浓度组MMP3及MMP9染色均为阳性，且随浓度的加大颜色加深（图1）。对MMP3及MMP9免疫组化结果进行计算机图像分析，施加TNF-α的各浓度组与对照组相比，MMP3及 MMP9染色灰度值分别有显著差异（P＜0.05，表1），可见TNF-α对体外培养的牛眼小梁细胞MMP3及MMP9的表达有促进作用。
2.3 TNF-α对小梁细胞TIMP-2表达的影响 随着TNF-α浓度的增加，TIMP-2的含量逐渐减少，且在同一浓度下，随着TNF-α作用时间的延长，TIMP-2 的含量减少。可见，TNF-α对TIMP-2的表达有抑制作用（表2）。
3讨论
POAG的病因和发病机制尚不清楚。近年来研究表明，POAG是房水引流阻力增加所致，这与小梁细胞功能活动密切相关。小梁细胞合成与分泌的ECM蛋白增多和/或降解这些ECM成分的酶减少，均可导致小梁网ECM堆积，造成房水引流阻力增加[4]。MMPs是一族降解ECM成分的中性含锌蛋白酶类，其按底物不同可分为胶原酶，明胶酶(包括MMP9等)，基质溶解酶（包括MMP3等）及膜型基质金属蛋白酶。正常情况下它们以无活性的酶原形式分泌，通过蛋白水解切断反应在细胞外被激活。MMP3可特异性降解蛋白多糖，纤维粘连蛋白及层粘连蛋白等；MMP9可降解变性胶原分子及天然Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅺ型胶原。基质金属蛋白酶的活性受很多因素调节，除许多非特异性抑制物如α2-巨球蛋白外还存在着其特异性的抑制物，即TIMP-1和TIMP-2。这两种抑制物均可与具有生物活性的基质金属蛋白酶以1∶1的分子比例非共价结合，但与不具有生物活性的基质金属蛋白酶则成紧密结合在一起的复合物形式。有研究表明，体外培养的人及牛眼小梁细胞可分泌MMPs及TIMP[5]。白介素（IL-1α）可使培养的人眼小梁细胞MMP3，MMP9及TIMP-1表达增加，此作用可被地塞米松拮抗[6]。TGFβ1可以通过控制小梁细胞的增殖、分化、血管形成及ECM合成等途径参与眼前段健康的维持。它还可与细胞膜上的相应受体结合参与小梁网房水引流的功能活动[7-10]。Bradley等[11]的研究表明，在体外人眼房水流出模型中，提高MMPs活性可增加房水流出率。因此对小梁细胞MMPs进行深入研究对于阐明POAG的发病机制具有重要意义。
氩激光小梁成形术(argon laser trabeculoplasty, ACT)是在180啊?60?觷房角的小梁网做微小的、非穿透性烧灼。眼压描记和房水荧光摄影研究表明ALT使眼压下降的机制目前尚不十分清楚。早期的理论认为小梁网受到激光烧灼后会引起小梁网胶原皱缩，烧灼点之间的小梁网间隙被拉大，小梁环（trabecular ring ）圆周缩小，后者使Schlemn管扩张，房水流出增加。遗憾的是这种解释至今未能在动物和离体人眼的组织学研究中得到充分的支持。近年来的组织细胞培养及病理电镜表明，激光对小梁网细胞的生物热效应可以刺激吞噬细胞，促进新的小梁细胞产生与以前不同的细胞外基质（ECM），这种与以前不同的ECM对反房水流出的阻力较小。有人用低能量的氩激光（≤20mW）照射滤帘，在开角型青光眼也产生了同常规能量ALT相似的降眼压效果。这一事实表明，ALT的降眼压过程可能还有其他因素参与[12,13]。
TNF-α是体内一种十分重要的炎性因子，是由激活的巨噬细胞和肿瘤细胞合成的分泌性蛋白。它是多功能的多肽，在免疫及炎症过程中发挥多种调节作用。有学者认为，激光小梁成形术后，青光眼之所以可以得到，可能与激光在眼内局部形成无菌性炎症，产生了TNF-α有关。TNF-α调节MMPs和TIMP-2的活性影响房水流出阻力，使眼压下降。
本研究表明：①牛眼小梁细胞体外表达MMP3和MMP9，这与Alexander等[14]的研究结果一致。②TNF-α可促进眼小梁细胞MMP3和MMP9的表达，其分泌量和活性与TNF-α的浓度及作用时间呈正相关。不仅如此，TNF-α还可抑制TIMP-2的表达，从而使小梁细胞ECM降解增加，堆积减少，细胞外间隙增宽，使房水引流阻力减少，这一发现对激光小梁成形术治疗青光眼的原理从另一个层面进行了阐明和解释，至于为什么TNF-α能降低眼压，其机制不十分清楚。为弄清这个机制，我们对此作了深入的研究。至于TNF-α究竟是通过何种途径使小梁细胞MMP3和MMP9表达增加，TIMP-2表达减少，还有待于进一步研究。
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