兔眼IPE与RPE细胞膜表面K-NPPase酶组织化学的电镜图像分析
【摘要】 为了探讨自体虹膜色素上皮细胞（IPE）能否代替视网膜色素上皮细胞（RPE）移植到视网膜下腔执行物质转运功能，对兔眼IPE与RPE细胞膜表面的Na+，K+-ATPase采用K-NPPase酶组织化学技术进行定位和分析比较。方法：家兔12只，取IPE和RPE组织固定，配制孵育液后进行K-NPPase酶组化孵育，制成电镜标本，采集图像，利用Metamorph/DP10/BX51系统进行分析。随机选取IPE细胞膜以及RPE细胞顶端相邻K-NPPase颗粒两点间的距离进行测量。每组样本的均值±标准差（x ±s ），进行成组设计材料的t检验。结果：有色素组与无色素组汇总后的IPE细胞膜上K-NPPase颗粒的距离平均值40.16±1.19nm，RPE顶端微绒毛细胞膜上K-NPPase颗粒的距离平均值为41.07±1.78nm，两者之间的差异无显著性意义（0.5＞P ＞0.2）。 结论：兔眼IPE细胞膜表面与RPE细胞顶端微绒毛膜表面均有Na+，K+-ATPase分布，采用K-NPPase酶组化电镜观察到的兔眼IPE细胞与RPE细胞可能具有相似的物质转运功能。
【关键词】 虹膜色素上皮细胞
0引言
近年来，随着视网膜玻璃体手术技术和细胞培养技术的成熟，通过自体色素上皮细胞移植老年性黄斑变性（ARMD），提高和挽救ARMD患者的视力成为可能。由于虹膜色素上皮细胞（IPE）与视网膜色素上皮细胞（RPE）有相同的组织来源，且取材容易，人们寄希望于通过自体IPE细胞移植来重建视网膜光感受器复合体的结构与功能。大量报道也证明了IPE细胞与RPE细胞具有相似的吞噬功能[1-4]、摄取和贮存维生素A的功能[5]及产生细胞外间质的功能[6]，但是关于二者物质转运功能的量化比较研究甚少。我们通过钾依赖性对硝基苯磷酸酶（K-NPPase）组化方法[7]显示IPE与RPE细胞膜表面的钠钾ATP酶（Na+，K+-ATPase），对二者的物质转运功能进行量化分析比较，为进一步阐述IPE代替RPE自体移植的可行性提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料 健康有色素家兔与白色家兔各6只，由医科大学实验动物部提供，质量2.5～3.0kg，平均兔龄6mo，雌雄不限。成组设计为有色素组12眼和无色素组12眼；有色素组和无色素组又分别分为IPE组和RPE组各12例。耳缘静脉注射5.0mL空气处死后，无菌操作下摘取家兔双眼球。用40g/L多聚甲醛和5g/L戊二醛混合液（含60g/L蔗糖）球内灌注及浸泡固定，4℃，45min，将组织切成2mm×4mm的薄块。
1.2方法 K-NPPase酶组化孵育液配制[7]：于1mol/L甘氨酸—KOH缓冲液（pH＝9.0）中加入左旋咪唑6.02mg及对硝基苯磷酸（Mg盐）24mg,充分混匀溶解，慢慢滴入DMSO 2.5mL（a液）将枸橼酸铅溶于50mmol/L的KOH溶液中配成4.0mmol/L浓度的溶液，摇匀使之溶解（b液）。将所配制的枸橼酸铅-KOH溶液（b液）缓慢滴入a液中，最终孵育液呈半透明微绿色。K-NPPase酶组化孵育：将组织薄块浸入孵育液中，置于37℃温箱中，孵育40~50min。将孵育后的组织薄块用100mmol/L二甲砷酸缓冲液洗涤5min；置于10g/L锇酸—100mmol/L二甲砷酸缓冲液中固定30min；用100mmol/L二甲砷酸缓冲液冲洗2次，各5min；依次用梯度乙醇脱水，再用纯丙酮浸30min 2次；环氧树脂（Epon812）浸透、包埋、聚合；切半薄切片后在光镜下定位，修块；超薄切片70nm，醋酸双氧铀染色10min，烘干；电镜观察，拍照。采用Metamorph/DP10/BX51系统分析电镜照片。随机选取IPE细胞膜上K-NPPase的阳性颗粒以及RPE细胞顶端和ROS相接的微绒毛上的阳性颗粒相邻两点间的距离进行测量。
统计学处理：计算每组样本的均值±标准差（x±s，95%可信区间），分别对有色素组和无色素组的IPE组与RPE组数据进行统计学分析比较，最后再对总的IPE组和RPE组进行t检验。
2结果
电镜下RPE细胞顶端伸出大量微绒毛包绕ROS，沿绒毛膜处可见K-NPPase颗粒沉积（图1）；IPE细胞之间有许多微绒毛互相交叉盘绕，在其表面可以见到大量K-NPPase颗粒沉积，沿细胞膜成行排列位于细胞质侧（图2）。这两种组织与其它未被K-NPPase着染的组织相比，定性观察结果呈明显阳性。有色素组与无色素组汇总后的IPE细胞膜上K-NPPase颗粒的距离平均值40.16±1.19nm，RPE顶端微绒毛细胞膜上K-NPPase颗粒的距离平均值为41.07±1.78nm，两者之间的差异无显著性意义（0.5＞P＞0.2，表1）。
图1 ①视杆细胞外节；②RPE细胞顶端；③微绒毛膜表面的K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色×35 000
图2 IPE细胞纵横交错的微绒毛边缘可见成排的K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色×35 000
3讨论
Schraermeyer等[8]应用酶联免疫细胞组织化学观察体外培养的IPE细胞具有Na+，K+-ATPase活性，但这只是定性观察结果。众所周知在RPE细胞顶端微绒毛膜上也存在Na+，K+-ATPase[9]，我们希望通过一种量化的方法比较二者的差异。Mayahara等[7]开发的钾依赖性对硝基苯磷酸酶（K-NPPase）组织化学方法，K-NPPase在钾离子存在的情况下，能水解对硝基苯磷酸，这个反应可以被Na+，K+-ATPase的特异性抑制剂奎巴因所抑制，而且在高倍电镜下K-NPPase的反应产物位于细胞膜的细胞质侧，这与Na+，K+-ATPase脱磷酸反应过程中磷酸释放的方向一致，更进一步说明K-NPPase是Na+，K+-ATPase中钾离子依赖性脱磷酸反应部分。K-NPPase在视细胞内节盘膜表面呈清晰排列（图3）代表了Na+，K+-ATPase的分布，是光感受器进行正常光电化学反应的前提与基础[10]。我们通过K-NPPase组织化学方法来显示正常生理状态下IPE与RPE细胞膜表面的Na+,K+-ATPase的活性分布，并创造性的通过Metamorph系统测量电镜图像中K-NPPase沉积颗粒的距离，对其分布密度进行量化评价、分析比较。
图3视网膜外核层明显可见K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色×18 000
K-NPPase酶组化孵育液的配制需严格遵循Mayahara等[7]开发的K-NPPase酶组织化学方法。其pH值要求很高，只有在pH＝8.8～9.0时K-NPPase活性才能显示出来。孵育液中加入左旋咪唑是为了抑制其他非特异性碱性磷酸酶活性，加入DMSO可以增强K-NPPase的活性，加入枸橼酸铅捕捉剂可以与Na+,K+-ATPase水解ATP后释放的游离磷酸根离子发生沉淀反应。固定液采用了40g/L多聚甲醛和5g/L戊二醛混合液（含60g/L蔗糖），可以使K-NPPase在足够长的时间内（＜1h）不失活，而同样含NPPase的Mg2+-ATPase在此固定条件下则完全失活，由此排除了Mg2+-ATPase反应颗粒对本实验的影响。K-NPPase酶组化电镜染色与其他电镜染色不同之处在于未加入枸橼酸铅，而只用醋酸双氧铀进行染色，目的是为了能分辨出细胞膜表面的K-NPPase，但缺点是未能使细胞器及细胞核膜等进一步着染。
我们通过Metamorph/DP10/BX51系统，对每张电镜照片的标尺进行换算后，测量相邻K-NPPase颗粒间距离。在数据采集的过程中，为了避免细胞膜重叠所造成的误差，我们选取了RPE与视杆细胞外节（ROS）衔接的部位，由于光感受器外节无Na+，K+-ATPase[10]，如本实验所观察到的（图3），可以认为与ROS相衔接的RPE细胞顶端微绒毛膜上的K-NPPase颗粒皆为RPE细胞所有；而为了避免IPE细胞之间紧密接触部位计数时对双层细胞膜表面的K-NPPase颗粒重叠计量所造成的误差，测量时选取了IPE游离的微绒毛表面的K-NPPase颗粒；另外，据记载RPE顶端与ROS衔接的部位Na+，K+-ATPase的密度较高（图4）[9]，因此特别选取该部位与IPE进行比较。尽管在不同的放大倍率下得到的组间的平均距离变异系数稳定(24.79±1.02)，但为了消除放大倍率不同所可能产生的系统误差，所有被采集照片放大倍率仍被限定为35 000倍。值得注意的是，在电镜观察过程中[11]，可以发现有色素组的IPE或RPE细胞质内色素小体的膜上有成行排列的K-NPPase颗粒，本结果中IPE（或RPE）的有色素组与无色素组K-NPPase颗粒距离的差异有非常显著性意义（P＜0.001）。故我们推测这种差异可能与细胞质内含有色素颗粒的多少有关。
图4 ①黑色素颗粒；②视杆细胞外节盘膜；③RPE细胞层；④脉络膜血管腔；⑤RBC；⑥Bruch膜构成完整的光感受器复合体，进一步放大可见RPE顶端具有K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色×27 500
在本实验中，有色素组的IPE组与RPE组的差异无显著性意义（0.5＞P＞0.2）；无色素组的IPE组与RPE组的差异有非常显著性意义（P＜0.001）；有色素组和无色素组汇总后的IPE细胞膜上的K-NPPase酶颗粒的距离平均值40.16±1.19nm，RPE细胞顶端微绒毛膜上K-NPPase颗粒的距离平均值为41.07±1.78nm，二者的差异无显著性意义（0.5＞P＞0.2）。由此可以推知IPE细胞膜上K-NPPase颗粒的密度与RPE顶端的微绒毛膜上的密度相近，也就是Na+，K+-ATPase的密度相近，故推测兔眼IPE细胞与RPE细胞具有相似的物质转运功能。我们通过对兔眼IPE细胞和RPE细胞物质转运功能的量化比较研究，初步证明了IPE细胞完全可能代替RPE细胞在视网膜下腔发挥物质转运功能，重建光感受器复合体的结构与功能。结合以前的相关报道，IPE细胞与RPE细胞生理功能的很多相似之处。相信，随着研究的进一步深入和我们对IPE和RPE细胞生理功能认识的加深及IPE细胞培养技术的成熟和玻璃体视网膜手术的不断，自体IPE移植将有希望为ARMD患者带来光明。
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