色素家兔脉络膜新生血管中结缔组织生长因子表达
作者：覃冬菊，唐罗生，刘湘平，唐朝珍
【摘要】 目的：通过激光诱导色素家兔脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）模型，探讨结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）在CNV形成中的作用。方法：用高强度半导体泵浦的倍频Nd：YAG 532nm绿激光光凝兔视网膜后极部，诱发CNV。术后1，3，4wk用原位杂交方法检测 CTGF mRNA在CNV中的表达。结果：光凝后1wk，CNV膜开始形成，CTGF mRNA主要表达于CNV及其附近；光凝后3，4wk，CTGF mRNA仍明显表达，并有增强的趋势。结论：结缔组织生长因子可能参与了实验性CNV的发生。
【关键词】 脉络膜新生血管
0引言
黄斑区脉络膜新生血管(choroidal neovasculariz- ation,CNV)膜形成是年龄相关性黄斑变性(age-rela- ted macular degeneration,AMD)、高度近视眼等眼底病中造成视力丧失的最主要原因。实验诱导和手术切除新生血管膜的组织学和免疫组织化学研究证实多种生长因子包括血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TFG-β）等在CNV形成的促进作用[1-5]。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是新近报道的高度保守的即刻早期基因CNN(CTGF,cyr,nov)家族成员之一，它在伤口愈合和纤维化过程中起主要作用[6-8]。最近的研究认为CTGF在促进纤维化过程中，也促进血管形成，在体内、体外都促进血管内皮细胞的生成、增生和迁移[9,10]。但目前鲜见对CTGF和CNV关系的研究，我们希望通过激光诱导的CNV膜型探讨CTGF在CNV形成中的作用。
1材料和方法
1.1材料 健康有色家兔24只，右眼为实验眼，左眼为正常对照。雌雄不限，体质量1.5～2.5kg，由中南大学湘雅二实验动物中心提供。实验前经裂隙灯、眼底镜检查双眼无异常。原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德公司。因为人和兔有95%的同源性，选用针对人CTGF靶基因的mRNA序列为5’-CTGCT GCCGC GTCTG CGCCA AGCAG CTGGG -3’，合成的探针用地高辛5’末端标记。DAB显色剂等其他分析纯均购自武汉博士德公司。半导体泵浦的倍频Nd：YAG 532nm绿激光机（法国Quantel Medical SA公司的Viridis Twin型）；荧光素眼底血管造影仪（fundus fluorescein angiography，FFA）（日本Topcon 公司TRC-50Ex型）。
1.2方法 复方托品酰胺眼液和新福林散瞳，肌注盐酸氯胺酮（50mg/kg）和地西泮（2.5mg/kg）麻醉后，丁卡因角膜表面麻醉放置三面镜，用倍频Nd：YAG 532nm绿激光机，在视盘下方1～2PD击射20点。激光击射参数：光斑直径50μm ，功率0.8W，时间0.05s，光斑间距100μm；激光反应斑以见到有气泡出现或少量出血,提示Bruch膜被击穿为准，并于激光击射后7，21，28d麻醉动物行眼底彩色照像及FFA检查。于激光击射后不同时间段，用空气栓塞法处死动物，去除眼周软组织，下方标记后置于40g/L的甲醛溶液中固定24h，然后沿赤道部剖开，去除眼前节，取包括视盘及下方的全层眼球壁组织，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋，以激光斑为中心制成3μm厚的连续石蜡切片,一张常规HE染色光镜下观察CNV。选取含CNV激光斑的石蜡切片常规脱蜡至水。原位杂交方法测定CTGFmRNA的表达：30mL/L H2O2室温处理10min，30mL/L檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化30min，期间0.5mol/L PBS或DEPC水充分洗涤37～40℃进行预杂交4h，吸取多余液体，不洗，然后40～42℃杂交过夜。杂交后30～37℃水温的不同浓度的SSC充分洗涤，再滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶，每一步之间用0.5mol/L PBS充分洗涤。最后,显微镜下控制DAB显色时间，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察照像。步骤按照试剂盒说明进行，阴性对照用预杂交液代替杂交液染色。结果以细胞质内出现黄色或棕黄色为阳性信号。
2结果
在正常组织中，视网膜脉络膜未见CTGFm RNA表达（图1）。光凝1wk后，脉络膜新生血管膜形成。光镜下观察主要由色素性巨噬细胞、迁移增殖的RPE细胞、神经胶质细胞和长梭形的、胞体较大、胞核为卵圆形的成纤维细胞样细胞组成（图2）， CTGFmRNA一部分阳性标记位于CNV及附近梭形组织，另一部分阳性标记位于血管内皮细胞及神经节细胞层（图3）。随着CNV发展，CTGFmRNA阳性染色有增强的趋势。
图1 正常色素家兔视网膜CTGFmRNA阴性表达DAB×400
光凝术后1wk（A）光凝术后3wk(B)CNV形成（*标记）
图2 色素家兔视网膜HE×400
A：CTGF mRNA一部分阳性标记于CNV及附近组织DAB×400；B:另一部分标记于血管内皮细胞及神经节细胞层DAB×200
图3 CNV色素家兔视网膜CTGFmRNA
3讨论
在许多眼底疾病中，CNV是造成视力丧失的主要原因之一。目前CNV的确切的病因和发生机制尚不清楚，但一致公认CNV形成是一个多细胞多因子参与的生物过程，这个过程中除了血管内皮细胞的关键作用外，其他细胞如周细胞、纤维母细胞、巨噬细胞和其他炎症细胞也被发现在控制眼部血管形成中都有重要作用，而且还有大量的血管形成调节剂，包括氧、血管形成因子、抗血管形成因子、细胞外基质、炎症介质等的参与[11]。CTGF属于近年发现的一个新的即刻早期基因家族CCN（CTGF, Cyr61, nov）的成员。目前发现CTGF在TGF-β信号通路中起重要作用，CTGF是TGF-β部分生物学功能的下游介质，它具有多种生物学功能,如刺激多种细胞增殖、细胞粘附、趋化性、诱导血管生成[6-10]，促进细胞外基质成分产生等，在肺、肾、心肌纤维化、动脉粥样硬化及肿瘤等病变都有高表达[6,7]。
有研究表明VEGF可以提高牛视网膜内皮细胞和周细胞CTGF mRNA的表达，呈时间依赖性和剂量依赖性，提出CTGF在视网膜新生血管疾病中有重要作用，可能参与血管形成和组织纤维化[10]。He等[12]分析研究了13例手术剥离AMD的CNV，并研究了CTGF对脉络膜内皮细胞（CEC）的作用。发现CNV膜上存在强烈的CTGF蛋白的表达，免疫双标记显示CTGF在RPE和CEC细胞上共同表达。可以显著诱导CECs的粘附和移行，但不刺激CECs增生。转化生长因子TGF-β和VEGF均可以上调CECs中CTGF蛋白的表达。而Watanabe等[3]同样的研究发现CTGF、TGF-β在CNV膜血管内皮细胞、RPE细胞及间质细胞（成纤维细胞样细胞、多角形血管周细胞）中强烈表达，并且纤维成分占主要的CNV 膜中的CTGF阳性信号强于细胞成分占主要的CNV膜，而TGF-β的表达相反。结果表明TGF-β上调CTGF表达，CTGF在脉络膜新生血管形成的病理过程中有重要作用。我们发现，光镜下CNV膜由色素性巨噬细胞、迁移增殖的RPE细胞、和长梭形的成纤维细胞样细胞组成，CTGFmRNA一部分阳性标记位于CNV及附近梭形组织，另一部分阳性标记位于血管内皮细胞及神经节细胞层。这类细胞是否分泌CTGF或有CTGF的受体存在，还需要进一步的实验证实。在激光诱导的CNV膜中，CTGFmRNA在光凝后1wk有阳性表达，光凝后3，4wk，随着CNV膜的发展，CTGFmRNA阳性表达增强。这可能是因为 CNV膜形成是个创伤愈合过程，它包括3个阶段：炎症、增生、重塑。在CNV膜形成初期，细胞多纤维少，处于炎症、增生阶段，这一阶段TGF-β被上调，而CTGF未被上调 ，间质细胞只有微弱的CTGF表达。随着CTGF被上调，来源于间质细胞的CTGF刺激胞外基质的产生，刺激纤维形成。随后血管周细胞发生纤维变性促进CNV膜的发展纤维化[3]。这可能是CNV膜后期退化的原因。
尽管激光诱导的CNV模型和人新生血管的发生机制不同，但我们的研究证实CNV膜中有CTGFmRNA的表达，提示CTGF参与了CNV膜的形成和发展，但CTGF在CNV膜中的作用方式和基因调控机制还需要进一步的研究。
【】
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