基因内含子突变与视网膜色素变性的研究进展
【摘要】 以往，人们认为内含子中的随机突变对生物不会产生严重的影响。但近些年来，随着人们对内含子和基因序列功能研究的不断深入，发现在mRNA剪切过程中，如内含子中分支点或内含子与外显子拼接处发生碱基的改变，往往会造成剪切点改变，从而导致编码的蛋白质功能异常。本文对内含子的功能，以及发生在内含子的基因突变与视网膜色素变性的相关分子遗传学研究概况做一综述。
【关键词】 内含子 功能 视网膜色素变性
Progress in the research of mutation of genetic intron and retinitis pigmentosa
AbstractPeople used to think that random mutations in intron had no significant effect on organism. But now, with the deep research of functions of intron and genetic sequence, we find that the base alteration taken place in intron may cause the splice site change and produce dysfunction codogenic protein. The article reviews the researches of gene mutation in intron and the studies on the molecular genetics of retinitis pigmentosa.
· KEYWORDS: intron; mutation; retinitis pigmentosa
0引言
视网膜色素变性（retinitis pigmentosa, RP）是由于视网膜感光细胞和色素上皮细胞变性导致夜盲和进行性视野缺损的一种常见的、遗传性、致盲性眼底病, 具有较大的临床和遗传异质性。RP的遗传方式分为常染色体显性遗传(autosomal dominant RP,ADRP)、常染色体隐性遗传(autosomal recessive RP, ARRP)、X-连锁遗传(X-linked RP, XLRP),少数患者表现为双基因和线粒体遗传；另有50%的患者以散发形式存在（ＳＲＰ）。迄今发现导致RP的致病基因散在于不同的染色体上,以各种不同方式的突变决定着RP的性状。每种遗传方式都有多个基因被克隆。过去人们往往把研究热点集中于基因的外显子（exon）部分，近来的研究表明发生在内含子（intron）的突变很可能与视网膜色素变性的发生存在着一定的关联，本文就该研究领域现况及前景做一简要综述。
1内含子的定义
1977年麻省理工学院的Phillip Sharp和冷泉港实验室的Richard Roberts等发现了断裂基因（splitting gene），使人们对基因结构的认识产生了一次质的飞跃。此工作获1993年诺贝尔生与医学奖。内含子（intron）通常的定义是：断裂基因中外显子(exon)的间插序列(intervening sequence, IVS)，可参与前体RNA的转录，但其转录的RNA序列于转录后的加工中被切除，不包括于成熟的RNA分子中，也可以说是断裂基因中的非编码区序列(图1)。需要说明的一点是本文所涉及的所有内含子都指的是RNA内含子，而非蛋白质内含子（intein）。
图1 真核生物基因结构示意图
2内含子的分类与分布
根据存在的宿主不同可以分为：mRNA内含子、tRNA内含子、rRNA内含子、snoRNA内含子和snRNA内含子等；根据其核苷酸序列和RNA潜在折叠方式不同，可分成4种类型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类内含子。Ⅰ类内含子存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的rRNA基因中，极个别的存在于原核生物的噬菌体中。Ⅱ类内含子主要见于细胞器(如线粒体)、细菌中。这两类内含子的拼接反应是由IVS自身催化的。Ⅲ类内含子(又称核mRNA前体内含子)最为常见，即绝大多数真核细胞前mRNA中的内含子。Ⅳ类内含子（又称核tRNA前体内含子）是tRNA的基因及其初级转录产物中的内含子。
3内含子的起源与进化
有两种假说：先起源(intron-early，IE)和后起源(intron-late, IL)。前者认为内含子存在于原始生命体基因组内，在生物进化中发生了内含子的丢失或转移，从而导致了内含子多态性[1-3]；后者认为内含子不存在于原始生命体的基因组内，而是由于DNA片断的插入或功能基因的突变产生的[4,5]。综合起来，有理由推测：内含子在原始基因中就己存在，而且当时内含子的序列与外显子序列有一定的同源性，也可以含有一些原始的基因；在进化中，仍有一部分内含子继续保留并其内的基因，还有一些内含子获得或形成了次生性的基因，可移动性增强，在基因组中移位或扩增，产生了“后起源”的内含子。因此，在基因组中，“先起源”和“后起源”的内含子是同时存在的。对于含有基因的内含子来说，其内基因的种类就可在一定程度上反映出其起源。
4对内含子功能的探讨
过去，人们把内含子看作是DNA通过膨胀缓解进化压力的“有效浪费”，并认为它含而不显。研究表明非编码区在细菌中只占整个基因组序列的10%~20%，而在人类则占到95%~97%。同时，作为非编码序列重要成分之一的内含子与生物等级成相关性。从生物进化的角度来看，内含子在生命活动中必定执行着某种或某些特殊功能。 对内含子一维序列结构和信息结构及生物功能的研究己经取得一些结果，越来越多的研究发现内含子与基因转录调控有关[6-8]。内含子具有多样性功能的特征，如：对基因表达具有增强作用叫做内含子增强效应(intron-mediated enhancement, IME)，即充当增强子；有时也起抑制作用；可充当启动子 ；可充当介导因子；能够参与RNA编辑。许多小核仁RNA(snoRNA)和小核RNA (snRNA)都被编码在内含子内[9]，而且还有一些别的基因和假基因由内含子来编码[10]。内含子具有选择剪接功能。如图2所示，外显子被非编码的内含子隔开，在转录到mRNA分子时，它们可以不同的方式(如图中的123和134)再重新组装起来，结果就编码了不同的蛋白质。这就是RNA的“选择性剪切”(alternative splicing)，也叫基因的“选择性转录”功能。由于内含子的存在使选择剪接成为可能，从而可以由同一个基因产生功能不同甚至相反的蛋白[11]。这样不但增加了基因在转录过程中的多样性，而且也大大提高了基因在转录过程中的可靠性。
图2 基因中外显子 与内含子的关系示意图
5内含子突变与视网膜色素变性
RP的遗传学很复杂， RP候选基因的确切致病机制及其相互作用之间的关系尚不清楚。随着分子生物学的进展，人们认为在内含子与外显子交界处的内含子突变会导致外显子的缺失或内含子不被剪切,发生在内含子中间的变异也多会因为激活了隐性剪切位点而影响了正常剪切从而致病[1]。内含子作用的研究对于RP的病因研究将越来越重要。如果发生在内含子的基因突变与RP相关的作用被证实，将可以解释一部分RP患者的发病。
5.1与ADRP相关基因
5.1.1 RHO 在最早发现的RP致病基因RHO（rhodopsin）中，其内含子2的二核苷酸重复序列多态性位点和内含子3Rsa1限制性片段长度多态性位点上，所有存在pro23His突变的患者均存在相同的单倍型组成，而这种单倍型在正常人群中很少见 [12]。庄文娟等[13]在7个ADRP家系中发现１个家系在RHO基因第3外显子3′端下游第3个碱基处发生C-T转换，其11个成员中该位点呈T纯合子的1例，8例呈杂合子状态。推断该处发生的C/T多态性可能与RP的发生存在一种高诱导性相关。
5.1.2 PRPF31基因 PRPF31是mRNA前体剪切因子基因 (pre-mRNA splicing factor gene)，参与mRNA的剪切。 2001年，Vithana等首次发现在体内各组织广泛表达的PRPF31基因与RP有关[14]。PRPF31基因突变分散于外显子5、7、8、11以及第６内含子中，类型包括插入、缺失、错义突变和剪切点突变[15-18]。席兴华等[19]对一个５代ADRP家系进行基因测序分析，在PRPF31基因第5内含子21位点处发现一新的剪接位点杂合性碱基突变改变(IVS5-1G→A)，该家系中有症状患者和无症状轻型患者均存在此种杂合性改变,而家系中其他正常人及与该家系无血缘关系的对照组正常人均无此种改变。因此，此突变可能是导致该家系RP发病的根本原因。陆莎莎等[20]报道一个4代ADRP家系，所有患者的PRPF31基因第8内含子的第一个碱基发生杂合突变（G→C），使得内含子8的剪切供体由GT变为CT（IVS8+1G→C）。此单个碱基的突变与疾病表型在家系的所有患者中呈共分离现象,且在家系未患病成员和100名相关人群中未见这一改变,从而排除了该杂合突变是罕见多态性的可能性。它至少会通过影响功能性U4/U6+U5三聚体的形成而影响细胞内前体的剪切过程[5]。因此认为该家系中这一剪切位点突变是其致病突变。
5.1.3 PDE6B 基因 Margaret等在 92例 ADRP患者中，发现PDE6B基因内含子的碱基突变有7种，其中有4种证实为多态性，有两种与剪切位点改变有关。1993年，Mclaughlin等[21]报道的一类似家系，其先证者是复合性杂合突变，既携带PDE6B基因第3外显子leu220His突变，又有第8内含子 (第9外显子上游10bp处)的点突变 (G→A)。他的3个女儿均只遗传其中一种突变，均系RP患者。在此家系中，不难看出内含子的改变与 RP发病存在相关关系。
5.2与ARRP相关基因
5.2.1 RHO基因 李宁东在对一ARRP家系先证者RHO基因序列分析中发现，第1外显子上游非编码区中第70个碱基出现A/G杂合，外显子5′下游非编码区第1185碱基为A/C杂合，这两个非编码区的改变是否是致病性基因突变或与RP有关的突变有待于进一步研究证实。
5.2.2 RP1基因 Bowne等[22]在60名ARRP先证者中发现RP1基因第1内含子的G→A（609-13）转换。Berson等[23]在一个ARRP家系的患者和家系成员中发现RP1基因的第2内含子出现了T→C转换(IVS2-6T→C)，由于在正常者的筛查中也出现较低频率的该改变，因此它非致病突变,但可能引起易感性改变。
5.2.3 PRPF31基因 Vithana等发现一ARRP家系RP677在PRPF31基因的第6内含子发生了长达42个碱基的缺失；ARRP家系RP1907则在第6内含子供体端第三个碱基发生了改变。李宁东在对一ARRP家系（CY家系）所有患者的PRPF31基因检测时发现其第6内含子均存在4个碱基CACA的缺失，而在正常者的筛查中未见这一改变。因此认为这一改变是CY家系致病突变。
5.2.4 PDE6B基因 崔云等测得一个ARRP家系患者PDE6B基因第11外显子5′端上游第19位碱基(第10内含子内)发生G→A转换。发现1例散发RP患者为一种复合杂合突变，即同时检测到第6外显子第2492位点碱基T颠换为C和第10外显子5′端上游(第9内含子内)第27~28碱基之间有两个碱基TG插入。另两例散发RP患者分别发现第4外显子5′端上游30~31碱基处两个碱基GT插入和第18外显子3′端下游第15个碱基发生G→C颠换。结果表明：这例散发RP患者所携带的内含子插入突变的致病分子基础还需进一步体外转录分析后才能清楚,但从家系遗传学分析这种复合杂合突变可能是致病原因；人的PDE6B基因内含子有多种变异。发生在内含子的突变属多态性还是与疾病有关,需进一步的检测。然而,对剪切机制的充分理解和探索内含子对基因表达的调控机制会促进对RP疾病的了解。
5.3与XLRP相关基因 RP3基因 又名视网膜色素变性GTP酶调节子(retinitis pigmentosa GTPase regulator, RPGR)。连锁分析研究表明,RP3型约占XLRP的70%~90%[24]。至今发现的突变有29种,其中剪切位点突变5种。Vervoort等[25]对整个基因内170kb的区域进行了测序,发现60%的XLRP患者在3′端外显子ORF15处存在突变,据此推断RP3的突变占XLRP患者的70%以上,并认为终末外显子ORF15处的突变是一个突变热点。有报道在英国人群47例XLRP患者中, ORF15处突变接近于80%。Miano等[26]在49例北美和美国XLRP患者中也发现29个RP3突变、8个家系中发现7个新的突变, 其中3个为剪切位点突变。Li Yang等[27]对中国人一个５代XLRP家系进行基因测序分析，在RP3基因ORF+483-484处发现有两个碱基GA缺失，造成阅读框架破坏。该基因缺失突变在家系中共分离，是家系的致病突变。
5.4与SRP相关基因
5.4.1 PDE6B基因 赵堪兴等检测了55例散发RP患者的PDE6B基因的22个外显子和5′端非编码区(5′－UTR)全基因扫描，发现1例散发RP患者同时检测到第6外显子第2492位点碱基T颠换为C和第10外显子5′端上游(第9内含子内)第27~28碱基之间有两个碱基TG插入。另两例散发RP患者分别发现第4外显子5′端上游30~31碱基处两个碱基GT插入和第18外显子3′端下游第15个碱基发生G→C颠换。崔云在一个散发RP病例中检测到PDE6B基因第9内含子（第10外显子5′-端上游）第21-22个碱基处有两个碱基GC插入，在100例无亲缘关系的正常人群中未检测到该突变。
5.4.2 RHO基因和RP1基因 王丹艺等[28]对151例香港地区汉族RP先证者和150名对照者进行了RHO基因和RP1基因全编码区和邻近剪切位点的内含子区域序列突变的检测。发现：（1）RHO基因非编码区-26G>A的发生率在病例组中显著高于对照组，提示这个SNP与RP的危险性增加有关，而RP1基因中R872H则可降低RP的危险性。多因素回归分析和单倍型体分析证实了这一结果。尽管-26G>A并不引起密码子改变,但提示除了致病性基因突变，非编码区的序列改变也可引起易感性改变；（2）该研究最重要的发现是RHO和RP1基因相互作用在RP发病中起作用。多因素Logistic回归分析揭示了RHO基因内含子区域IVS4-23G>A的突变分别与RP1基因N985Y和C2033Y两个位点之间存在相互作用。这种双基因遗传方式可能与RP中的高散发性,高度临床异质性有关。
6小结
目前一致认为，基因是由较短的称为外显子（exons）的编码序列，及很长的称为内含子（introns）的非编码序列组成的。
内含子自1977年发现以来，其起源、进化及功能的问题一直是争论的焦点，尤其是其功能方面。传统观点认为内含子没有生物学功能。其实，DNA序列作为一种遗传语言，不仅体现在编码序列之中，而且还隐含在非编码序列之中。近年来有人在不同物种发现了具有保守性的内含子，所以人们也开始了对基因组中的“沙漠区域”——内含子进行了不断的研究，已从理论和实践两个方面改变和深化人们对所谓的“junk”序列的认识。有证据表明，曾被认为是无编码意义和无确切生物功能的内含子，虽然在mRNA加工过程中被剪切掉，但仍具有其特定的功能，至少在维持mRNA前体稳定性、翻译和转录过程的调节中发挥重要作用，甚至在进化过程中承受一定的选择压力[4]。
迄今人们对RP的研究和认识越来越多,特别是就内含子、内含子的功能，以及发生在内含子的基因突变与视网膜色素变性相关的发现给RP的遗传病因学研究带来了全新的概念。但是，它们之间究竟有着怎样的内在联系呢？我们目前的知识累积还是远远不够的。相信随着细胞生物学、分子生物学和基因工程研究和实践的进展，在今后临床医师和基础科研工作者的不懈奋斗下，我们会逐渐揭开内含子神秘的面纱和RP的发病机制，同时希望能早日为RP患者解除痛苦。
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