角膜新生血管治疗的研究进展
【摘要】 多种病理因素可以导致角膜新生血管形成，新生血管化的角膜常导致视力严重下降、角膜移殖术失败。近年来，国内外对角膜新生血管的在药物治疗、光动力疗法、眼表重建术等方面做了大量的研究，并取得迅猛。本文综述了角膜新生血管的治疗研究进展。
【关键词】 角膜新生血管；治疗
0引言
角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）是与角膜炎症和角膜排斥反应密切相关的常见病理现象。CNV对感染清除，伤口愈合，抑制角膜溶解等有一定作用，但它能破坏角膜正常微环境，从而破坏眼前节生理免疫赦免状态，是角膜移植排斥反应的高危因素；新生血管结构较脆弱，易渗透，常因出血渗出及继发纤维化等导致失明，是目前最常见的致盲原因之一。近年来，随着新生血管研究的发展，国内外针对CNV治疗研究的动物实验和临床试验亦大量进行，其中的许多结果显示出良好的临床应用前景。
1抑制内皮细胞增殖移行
1.1血管生成抑制素 血管生成抑制素（angiostatin, AS）是最早获得的内源性血管生成抑制剂之一，它由纤溶酶原片段的头4个水解片段kringles组成。AS通过干扰细胞G2/M过度抑制内皮细胞繁殖和诱导内皮细胞凋亡；AS与其受体α/β-ATP合成酶结合时，通过抑制ATP合成酶的活性，阻止内皮细胞的增殖和迁移； AS通过与血管内皮细胞特异黏附受体如整合蛋白αvβ3结合抑制内皮细胞增生，同时也阻断了有其介导的VEGF，bFGF，TGF-α等的促内皮细胞增生和血管生成作用的共同通路。Warejcka等[1]研究发现在角膜上皮层、间质层、内皮层组织提取液及角膜条件培养液中存在纤溶酶原、纤溶酶原mRNA、AS；在角膜上皮细胞、间质成纤维细胞或肌纤维母细胞培养液中未发现有AS，但是培养的角膜上皮细胞及间质成纤维细胞能将外源性纤溶酶原转化成AS，而来自于成纤维细胞培养液的AS能有效抑制血管内皮细胞增殖，证实纤溶酶原向AS转换具有细胞依赖性，并认为因为角膜细胞产生AS,所以利用人体角膜细胞产生的AS治疗CNV的同时又可以尽量避免药物的副作用。
1.2内皮生长抑制素 内皮生长抑制素（endostatin, ES）由胶原蛋白XⅧ 的C末端非胶原区内的184个氨基酸片段构成，能特异性地抑制血管内皮细胞迁移，增殖及基质金属蛋白酶-2（metalloproteinase-2, MMP-2）的活性，还可通过诱导抗凋亡蛋白bd2、bclXL及促凋亡蛋白bax的失衡影响内皮细胞的生存而抑制血管新生。Zhang等[2]在对碱烧伤诱导的老鼠CNV模型结膜下注射ES时发现，在第6，10，15d时CNV抑制率分别为37%，40.2%，42.8%，CNV密度抑制率为40%，但对CNV的生长长度及炎症细胞没有治疗效果。Feng等[3]用Mab，4E7（内皮生长抑制素对抗剂）在体外实验成功阻止ES的抗迁移/粘连效应；体内实验阻止ES的抗新生血管效应，但ES对内皮细胞增殖抑制始终未受MAb4E7的影响，提示 ES可能作为CNV较强的抑制剂而应用于临床。
1.3血管抑制因子 血管抑制因子（vasostatin,VS）是钙网织蛋白的N端片段（1-180氨基酸），具有抑制内皮细胞增殖、抑制血管生成的生物功能，是一种新型的血管抑制因子。研究证实将VS整合到腺病毒载体进入胰腺癌发现，虽然VS对胰腺细胞的影响轻微，但他抑制了新生血管的发生，有效地阻断了营养物质输送到恶性细胞。为了研究VS局部用药对角膜新生血管的影响，Wu等[4]将纯化重组体VS制成VS眼液用于bFGF诱导的CNV模型，结果发现无论有无bFGF或VEGF的存在VS均有效的抑制内皮细胞的生长而抑制CNV。
1.4大脑胞外区特异性血管生成抑制剂 大脑胞外区特异性血管生成抑制剂（extracellular region of brain-specific angiogenesis inhibitor 1,BAI1-ECR）通过功能性阻止内皮细胞上αvβ5粘合素而具有抗细胞增殖活性。Yoon等[5]用庚醇对老鼠行角膜上皮清创术诱导CNV，一组结膜下注射BAI1-ECR基因，另一组注射VEGF抗体，2wk后发现两组新生血管都被抑制，且抑制率几乎相等， BAI1-ECR可能是通过阻止血管内皮细胞的增殖而抑制CNV。
2抑制血管生成因子及其受体活化
2.1胰岛素受体底物-1 IL-1是由单核巨噬细胞产生的12-18kd单链多肽，具有重要的生理调节作用。培养人，家兔角膜上皮、内皮、基质细胞均产生编码IL-1的mRNA。过去的研究表明5ng的γIL-1α及100ng的γIL-1β缓释1～2d便可诱导家兔CNV。目前认为IL-1可通过直接或间接途径促进bFGF和VEGF表达，产生新生血管化；IL-1也是一种极强的炎症细胞因子，能通过炎症加强眼部新生血管化。胰岛素受体底物-1（IRS-1）是一个位处细胞质内，含复合加磷氧基作用点的蛋白质。它是胰岛素受体酪氨酸激酶的直接底物。该基因在葡萄糖产生、摄取和胰岛素（INs）产生的组织普遍表达，是胰岛素信息传递的重要介质。Berdugo等[6]研究发现CNV模型老鼠经结膜下注射IRS-1反义寡聚脱氧核苷酸（ASOND）10d后明显降低IRS-1与IL-1β的表达，ASODN治疗组与PBS对照组CNV覆盖角膜面分别为（59±20）%和（95.5±4）%，治疗组CNV受到明显抑制，其机制可能为IRS-1表达下降导致血管形成因子IL-1β表达下调而抑制CNV，IRS-1蛋白可能成为调节由胰岛素、低氧、炎症介导的新生血管的新靶点。
2.2匹格列酮 过氧化物酶体增殖子活化受体（peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs）是细胞核受体，属于配位基活化转录因子的类固醇超家族。PPARs包括α、β、γ三种亚型。其中PPARγ配基过去一直表明可以抑制实验性角膜和脉络膜新生血管。匹格列酮（ pioglitazone，PZ）属噻唑烷二酮类药物，它是PPARγ促效剂，临床上一直用于降低糖尿病患者血糖，改善胰岛素受体抵抗。Sarayba等[7]将26只老鼠分组，其中一组为VEGF诱导CNV组，二组在一组的基础上加PZ，1wk后发现一、二组平均新生血管面积分别为（2.87±0.48）mm2、（2.10±0.22）mm2；新生血管平均密度分别为27.14±2.93、12.02±2.24，其机制可能就是PZ通过促效PPARγ降低VEGF的表达而抑制CNV。
2.3环氧化酶-2抑制剂 环氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）抑制剂是诱导型酶，目前已知胃上皮壁细胞、肠粘膜细胞、单核一巨噬细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、滑膜细胞和成纤维细胞可表达COX-2。COX-2生理状态下在多数组织中处于静息状态或低表达，但在病理状态下，当细胞接受相应的刺激时，COX-2的mRNA和蛋白很快增加，活性增高，经COX-2作用的花生四烯酸代谢产物炎性前列腺素类被认为是促血管生成原。目前多种COX-2和(或)前列腺素合成抑制剂已用于减少肿瘤新生血管生成。Biswas等[8]在单纯疱疹病毒感染的角膜炎模型中发现COX-2大量表达，在病毒感染早期COX-2由间质的成纤维细胞产生，而随后则由侵入角膜的炎症细胞产生，当给予SC-236（选择性 COX-2抑制剂）10d后间质性角膜炎症明显缓解，同时降低了VEGF的表达，有效的抑制了CNV。
2.4 Flt-1 Flt-1是fms-样III型酪氨酸激酶受体，是VEGF 高亲和性受体之一。生理情况下，VEGF通过Flt-1和另一种跨膜型受体包含激酶插入区膜型受体（KDR）一起共同参与血管的形成、重塑和再植过程。Lai等[9]发现重组体可溶性Flt-1（sFlt-1）通过腺病毒载体转染至角膜上皮细胞能有效抑制CNV。Singh等[10]也研究发现在体外Flt-1内感受器（intraceptor）能抑制低氧诱导的角膜上皮细胞分泌VEGF；在体内Flt-1内感受器能抑制由损伤诱导的VEGF增量调节,阻止白细胞侵入及抑制CNV。
3内皮细胞特异性整和素/活化信号转导抑制剂
3.1 Tie2 Tie2受体是酪氨酸激酶型受体，特异性表达于内皮细胞。成熟机体血管内皮都有Tie2表达，而在增殖活跃的血管内皮Tie2的表达、磷酸化显著增加。缺乏Tie2基因的小鼠往往死于胚胎期的血管发育障碍，提示Tie2在血管发育中起着关键性的调节作用，干扰Tie2激活可以扰乱血管生成过程。Singh等[11]研究发现CNV模型的老鼠经腺病毒介导可溶性Tie2（sTie2）治疗4wk后能使CNV面积降低到空白对照组的50%，有效抑制CNV的形成和发展。
3.2整合素拮抗剂 整合素是一群由α,β多肽链组成的异二聚体分子，大多表达在白细胞表面。Zhang等[12]发现整合素α1 、β3亚单位和MT1-MMP的表达与VEGF诱导的新生血管有关，α1、α2、α6、β5亚单位和MMP-2、MTI-MMP表达于新生血管，β3亚单位主要表达于血小板上。他们得出整合素的表达与VEGF/αvβ5通路所诱导的新生血管形成机制有关，MMP-2与MT-MMP的表达与新生血管形成一致。Klotz等[13]评估αv整合素拮抗剂LM609和cRGDfV可能的抑制CNV形成的作用时发现，皮下注射cRGDfV显著减少bFGF诱导的新生血管生长，但对硝酸银烧伤模型无显著抑制作用，相对于对照组，囊袋内同时植入LM609则明显抑制角膜新生血管形成。表明阻断αvβ3整合素可抑制bFGF诱导的新生血管形成，而对化学烧伤模型无作用。
4基底膜与内皮细胞外基质降解抑制剂
新生血管的形成涉及毛细血管基底膜、细胞外间质的降解和重建以及内皮细胞的增殖迁移，细胞外基质是新生血管形成必须突破的屏障。MMPs是一簇能降解细胞外基质成分和基底膜的含锌蛋白酶，新近研究表明MMPs对新生血管的发生起着非常重要的作用。Samolov等[14] 研究发现CNV模型中MMP-2 mRNA及蛋白量表达增加，而MMP-2缺乏型中新生血管生长明显延迟。
金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）是基质金属蛋白酶特异性的组织抑制因子，对MMP活性及细胞增殖均有抑制作用。Ma等[15]研究TIMP-4在正常人角膜细胞及实验性CNV的表达中发现，培养的人类角膜细胞表达TIMP-4，而这一表达在促细胞分裂剂处理后仅仅有轻度的提高；TIMP-4免疫反应性主要在正常的老鼠角膜上皮上表达，也有一部分在向角膜内生长的新生血管表达，并持续到28d，从而证实角膜上表达的TIMP-4在与角膜伤口愈合以及新生血管发生有关的细胞外基质调整中发挥了重要的作用。Ma等[16]利用人类羊膜培养液介导并由其分泌的高浓度TIMP-2成功抑制了人类脐静脉内皮细胞的迁移和增殖以及bFGF诱导的CNV。
5基因治疗
基因治疗是目的基因与表达载体形成重组体后感染宿主细胞，再利用表达的目的蛋白治疗病变。眼球体积小，组织结构紧密，药物不易扩散至周围组织，以及与体循环相对分离的特点为基因治疗提供了良好的基础。
5.1 K5基因转染 研究证实纤溶酶原K5（kringle 5 of plasminogen）能有效抑制CNV，其机制可能是通过抑制VEGF的表达。Yu等[17]研究发现表达K5质粒能在COS细胞表达，K5转染的COS细胞条件培养液明显抑制了人类脐静脉内皮细胞增殖，RT-PCR和免疫组化证实K5在结膜与角膜表达，CNV受到K5基因转染的明显抑制。
5.2短干扰性RNA 短干扰性RNA（siRNA）是3末端带有2个核苷酸突出的21～23个核苷酸的dsRNA，研究表明siRNA一旦与mRNA中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就使基因“沉默”了。有报道证实利用siRNA靶向VEGF蛋白及其受体可成功抑制肿瘤的新生血管，也有报道将siRNA靶向MMP-9成功的抑制肿瘤新生血管。Kim等[18]利用siRNA靶向VEGFA,VEGFR1,VEGFR2有效抑制了单纯疱疹病毒诱导的CNV。
6其他
6.1曲安奈德 曲安奈德（triamcinolone acetonide, TA）作为一种长效糖皮质激素近年来越来越多地应用于眼科临床治疗中，多以玻璃体腔注射的给药方式治疗多种原因引起的黄斑水肿，减轻炎症反应、抑制增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发生和减少眼内新生血管的形成[19-22]。Murata等[23]首次在对bFGF诱导的兔CNV模型结膜下注射TA后发现，TA能有效抑制CNV，其有效浓度维持至少2wk，并且未见明显的副作用。其抑制机制可能是TA抑制巨噬细胞、肥大细胞及其它一些能释放肝磷脂生长因子的细胞的迁移和激活。
6.2雷帕霉素 雷帕霉素（rapamycin）是链球菌属丝状菌产生的一种具有抗真菌作用的大环内酯类抗生素，近年作为高效的免疫抑制剂应用于临床器官移植的抗排斥反应[24]。有报道发现AngⅡ诱导血管内皮细胞增殖活化通过PI3K-p70S6K和Ras—p42／p44MAPK两条信号通路，雷帕霉素可通过阻断p70S6K这一靶点抑制血管内皮细胞增殖，抑制细胞周期蛋白cyclin D的表达，阻止细胞G0／G1-S期。Kwon等[25]研究发现雷帕霉素在体外能有效抑制人脐静脉内皮细胞增殖，且不会引起细胞毒性和程序性细胞死亡，而在体内能有效抑制碱烧伤诱导的CNV，抑制机制有待进一步研究。
6.3光动力学疗法 光动力学疗法（photodynamic therapy, PDT）即借助某些特定药物(光敏剂)进入患者体内后，动态浓集于生长异常的组织，后者在一定波长光辐照下．因其所摄入药物(光敏剂)发生光动力敏化反应而产生单线态氧（1O2）等活性氧物质．导致生物大分子光氧化失活，并由此造成细胞器损伤而破坏目标组织以达到目的的方法。而眼新生血管易通过光化学反应导致选择性血管栓塞和管腔封闭，可以反复治疗而不损及周围组织，具有可行性和安全性。Fossarellou等[26]用Verteporfin介导PDT，以689nm激光照射15min，CNV迅速发生光栓塞，无副作用出现。Usui等[27]将枝状分子比咯紫质（DP）溶入聚离子合成物（PIC）微胶粒（DP-micelles），对CNV进行以DP-micelles介导的PDT，结果发现PIC微胶粒能很好的选择性积聚在CNV，而PDT利用DP-micelles则能有效而安全的治疗CNV。
6.4眼表重建术 由于免疫学、器官移植学的及角膜本身的免疫赦免，角膜移植已成为人类器官组织移植中最成功的一种移植术，研究至今已成功发展多种手术方式。根据CNV的部位和程度、角膜缘干细胞缺失的程度和角膜损伤严重的程度，主要有以下眼表重建手术抑制CNV：角膜缘移植、角膜缘移植联合板层或穿透性角膜移植、培养的角膜缘干细胞移植、羊膜移植、羊膜移植联合角膜移植、羊膜移植和角膜缘上皮移植联合穿透性角膜移植。目前大量动物实验及临床试验证实眼表重建手术可不同程度地抑制CNV。
总之，CNV是由多种病理因素共同作用引起，而目前的治疗研究仅针对单个或数个因素，新生血管常常不能受到理想的抑制或退化。因此，全面深入地研究CNV发生机制，探讨针对多种致病因素的多层次全方位的治疗方式将是我们面临的重大课题。
【】
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