人重组肿瘤坏死因子-α体外诱导人小梁细胞凋亡

             作者：胡义珍 纪彩霓 李贵刚 

【摘要】  目的：研究人重组肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α)对人小梁细胞（human trabecular meshwork cells，HTM ）凋亡的影响，探讨其在原发性青光眼发病中的作用机制。方法：组织块法原代培养人小梁细胞，取第3~5代细胞用于实验。不同浓度的rhTNF-α与细胞共同孵育24h，采用Annexin-ⅴ联合PI双染流式细胞术，测定细胞凋亡率，结合荧光显微镜来观查凋亡细胞。结果：浓度低于0.01MU/L的肿瘤坏死因子-α作用24h对人小梁细胞凋亡无明显影响, 浓度0.01MU/L及以上的肿瘤坏死因子-α作用24h可明显增加人小梁细胞凋亡率, 凋亡率与肿瘤坏死因子-α浓度成正比。结论：肿瘤坏死因子-α可以诱导体外培养的人小梁细胞发生凋亡，可能参与了青光眼发病中小梁细胞的损害过程。

【关键词】  小梁细胞 凋亡 肿瘤坏死因子-α 青光眼

     0引言

    小梁网细胞数目的减少是原发性开角性青光眼的重要病理改变之一。出生时人的小梁细胞的数目大约是750 000个，随着年龄的增大小梁细胞的数目逐渐减少[1]。据报道，原发性开角型青光眼与同年龄组正常人群相比，其小梁细胞的数目明显降低。但是，其数目降低的确切机制还不清楚,而细胞的死亡可能是它的原因之一[2]。坏死和凋亡是细胞死亡的两种不同的形式。 Fas和肿瘤坏死因子受体（TNF-R）同属于死亡受体，可以通过两种不同的信号转导通路诱发细胞的凋亡[3]。Agarwal等[4]于1999年证实了人小梁细胞（HTM）膜表达Fas并存在Fas诱导的凋亡通路。人小梁细胞的细胞膜表面也可以表达TNF-R1[5]。并且，虽然在正常人的房水没有检测到TNF-α的表达，但已证实葡萄膜炎及青光眼患者房水中表达有肿瘤坏死因子 [6]。是否存在TNF- TNF-R引起的凋亡通路呢？我们采用体外培养细胞的方法，旨在探讨肿瘤坏死因子对人小梁细胞凋亡的影响，现将结果报道如下。

    1材料和方法

    1.1材料  来源于意外死亡的成年男性（年龄20～40岁）眼球4只，无眼病史。死后6h内取回并取材培养。rhTNF-α（美国Sigma公司），DMEM/F-12 培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司），胰蛋白酶（美国Sigma公司）， Annexin-ⅴ凋亡检测试剂盒（北京宝赛公司）。流式细胞仪FACSort（美国B. D公司），倒置相差荧光显微镜（日本 Nikon公司），CO2恒温培养箱（德国 Heraeus公司），恒温离心机（德国 Heraeus公司）

    1.2方法  人小梁细胞的培养和鉴定参照贺翔鸽等[7]的方法，沿角巩膜缘后4mm环形剪开，去掉晶状体、虹膜、睫状体，将前节角膜上皮面朝下，将房角附着的色素组织清除干净，辨认白色的海绵状的小梁组织，用显微镊成条撕下，剪碎成块1mm×1mm，移入25cm2培养瓶中。置入37℃、50mL/L CO2培养箱中，6h后翻转培养瓶，加入含200mL/L胎牛血清的培养液，其中含1MU/L 庆大霉素，继续培养。每3～5d换液1次， 21d小梁细胞开始爬出，局部融合后，2.5g/L胰蛋白酶消化后传代。第4、5代的小梁细胞用于实验。将第4代的小梁细胞接种于铺有小盖玻片的6孔板中，待细胞长满80%，取出固定，用SABC法进行波蛋白和纤维连接蛋白免疫组化染色。取第4代人小梁细胞共7瓶（25cm2细胞培养瓶 ），空白对照1瓶，阴性对照1瓶，其它5瓶加入rhTNF-α，使其终浓度分别为0.01，0.1，1，10，100MU/L。放入50mL/L CO2恒温培养箱中，孵育24h。用2.5g/L的胰酶消化，将细胞移入离心管，1 000r/min 4℃离心3min, 弃上清。用缓冲液重悬细胞，1 000r/min 4℃离心3min, 弃上清，共2次。加入Binding Buffer200μL，空白对照只加PI（50mg/L）5μL，其它加入FITC标记的Annexin-V（20mg/L）10μL和PI（50mg/μL）5μL。室温避光反应30min。加入Binding Buffer300μL，立即用流式细胞仪（FACSort）进行检测。统计凋亡细胞数占细胞总数的百分比。将检测后剩下的细胞移入96孔板，在倒置荧光显微镜下观察、照相。活细胞拒染，坏死的细胞可被PI着染成橘红色，凋亡早期细胞膜可被Annexin-ⅴ-FITC着染成绿色，凋亡晚期细胞可被两种染料同时着染。

    2结果

    小梁细胞要3wk左右才从组织块周围长出，有细胞长出的组织块大约为20%~30%，原代细胞胞体呈细长的梭形，部分含有少量的色素，生长缓慢，约2wk后，细胞生长加速，达到局部融合，平均每个视野可见8~10个分裂期细胞，融合的细胞紧密相接，呈漩涡状。人小梁细胞层粘连蛋白、纤维连接蛋白染色阳性（图1A，B）。rhTNF-α与小梁细胞共同孵育后，可见培养瓶中少数小梁细胞变圆，甚至从瓶底脱落，培养液漂浮着细胞碎片（图2A）。阴性对照组细胞伸展、贴壁，呈多角形（图2B）。流式细胞仪检测空白对照只有少量PI阳性细胞，没有自发性绿色荧光。阴性对照组有少量细胞发生凋亡，rhTNF-α各浓度组细胞凋亡数明显增加，呈剂量依赖性（表1）。荧光显微镜下可见部分细胞Annexinⅴ-FITC染色阳性，胞膜染成绿色；少部分细胞PI染色阳性，细胞核染成橘红色；一部分细胞Annexinⅴ-FITC和PI双染阳性，即胞膜成绿色，胞核呈橘红色；大部分细胞染色阴性（图3A，B）。

    图1 人小梁细胞层粘连蛋白（A）、纤维连接蛋白（B）染色阳性。SP法，DAB显色，×200

    图2  rhTNF-α10MU/L与小梁细胞共同孵育后，可见培养瓶中少数小梁细胞变圆，甚至从瓶底脱落，培养液漂浮着细胞碎片（A）。阴性对照组细胞伸展、贴壁，呈多角形（B）。倒置相差显微镜×200

    图3A  rhTNF-α0.1MU/L作用24h后、悬浮的小梁细胞在荧光显微镜下可见细胞膜被均匀染成绿色的凋亡早期细胞，正常细胞拒染。B  rhTNF-α10MU/L作用24h后、悬浮的小梁细胞在荧光显微镜下可见：拒染的正常细胞；细胞膜被染成绿色、细胞核被染成橘红色的凋亡晚期细胞；只有细胞核被染成橘红色的坏死细胞。Annexin-ⅴ-FITC联合PI双染，×200

    3讨论

    小梁细胞数目的减少被认为是青光眼发病机制之一，当青光眼并发炎症时可以通过多种机制引起小梁细胞数目的下降，如炎症细胞的吞噬作用、细胞迁移和死亡等[5]。而死亡可以由坏死和凋亡两种在分子水平上完全不同的机制引起，凋亡可以由配体与细胞膜表面上的受体特异性结合而诱导，也可以由凋亡抑制剂阻断。Wordinger等[4]已经证实人小梁细胞膜表面存在TNF受体-1，但是人小梁细胞是否存在TNF诱导的凋亡通路，国内外还没有报道。我们采用Annexin-ⅴ-FITC联合PI双染法流式细胞术，分析不同浓度rhTNF-α的诱导小梁细胞凋亡作用。其原理是，在细胞凋亡的早期，正常位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS），可翻转到细胞膜的表面，与荧光素FITC标记的Annexin-ⅴ高亲和力特异性结合，从而可着染早期凋亡细胞。碘化丙啶(PI) 可以透过凋亡中晚期和死细胞的细胞膜，而使细胞核红染，而正常细胞对两种荧光标记均拒染。结果显示，rhTNF-α在浓度为0.01MU/L时就可以诱导体外培养的小梁细胞发生凋亡，凋亡百分数为3.65%，随着浓度的增加凋亡细胞数也逐渐增加，呈剂量依赖性。rhTNF-α浓度达到100MU/L时，凋亡细胞达到18.44%，而坏死的细胞数没有明显的差异。说明rhTNF-α可能主要是通过诱导凋亡引起细胞数目的下降，而不是坏死。

    正常人房水没有TNF-α，但眼部并发葡萄膜炎、糖尿病性视网膜病变时，房水内TNF-α水平增高，可达2～24mg/L[6] (相当于6～72MU/L)，足以引起小梁细胞明显的凋亡，从而引起小梁细胞数目的减少，加重原本已经存在的青光眼，或引起青光眼的发病。而且青光眼病人视网膜TNF-α及其受体表达增高,其介导的细胞死亡是青光眼性视神经损害的原因之一[7,8]。因此，阻断TNF-α诱导的凋亡通路，可能起到防治青光眼的作用。

【】
  1 Grierson I, Howes RC. Age related depletion of the cell population in the human trabecular meshwork. Eye, 1987; 1: 204-210

2 Grierson I, Hogg P. The proliferative and migratory activities of trabecular meshwork cells. Prog Retinal Eye Res, 1995; 15: 33-40

3刘兵,马吉献,惠延年.IL-1β和TNF-α对体外培养的人RPE细胞FasL蛋白及mRNA表达的影响.国际眼科杂志,2005;5(5):916-918

4 Agarwal R, Talati M, Lambert W, Clark AF, Wilson SE, Agarwal N, Wordinger RJ. Fas-activated apoptosis and apoptosis mediators in human trabecular meshwork cells. Exp Eye Res, 1999; 68: 583-590

5 Wordinger RJ, Clark AF, Agarwal R, Lambert W, Mcnatt L, Wilson SE, Qu Z, Fung BK. Cultured human trabecular meshwork cells express functional growth factor receptors. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1998; 39(9): 1575-1589

6 Franks WA, Limb GA, Stanford MR, Ogilvie J, Wolstencroft RA, Chignell AH, Dumonde DC. Cytokines in human intraocular inflammation. Curr Eye Res , 1992; 11(Suppl): 187-191

7贺翔鸽,李美玉.人眼小梁细胞培养及免疫组化特性研究.中华眼科杂志,1998;34(4):280-282

8 Tezel G, Li LY, Patil RV, Wax MB. TNF-alpha and TNF-alpha receptor-1 in the retina of normal and glaucomatous eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001; 42(8): 1787-1794