TGF-β2刺激人Tenon囊成纤维细胞增殖，表达CTGF和合成Fn
【摘要】 目的：研究转化生长因子（TGF-β2）和结缔组织生长因子(CTGF)在滤过泡瘢痕化中的作用。 方法：用不同浓度的TGF-β2刺激HTF，然后用RT-PCR和免疫细胞化学法分别检测CTGF和Fn的表达，用MTT法检测细胞的增殖。 结果：TGF-β2 2μg/L到5μg/L范围有剂量依赖性地促进HTF的细胞增殖，CTGF的表达和Fn的合成的趋势(P <0.01),但0.5μg/L，1μg/L与正常对照组对细胞的增殖作用差别无显著性，5μg/L与10μg/L增强细胞的增殖作用也无显著性差异（P >0.05）。 结论：TGF-β2能够明显地促进HTF细胞增殖，并增强其下游介质（CTGF）的表达和合成细胞外基质-纤维连接蛋白（fibronetin, Fn）。
【关键词】 结缔组织生长因子 转化生长因子-β2 纤维连接蛋白 Tenon囊成纤维细胞 青光眼滤过术
0引言
青光眼滤过术后滤过泡的瘢痕化是手术失败的关键原因，滤过泡瘢痕形成机制涉及很多生长因子，有研究表明与滤过手术联系最密切的则为转化生长因子TGF-β2[1]。结缔组织生长因子（CTGF）是继TGF-β之后发现的又一个重要的促纤维化因子，被认为是TGF-β的下游作用元件以及纤维化进程的启动因子[2]，其作用主要表现为促进细胞有丝分裂和增生、趋化细胞、诱导细胞粘附、促进细胞外基质(ECM)的合成[3]，针对CTGF的有可能开辟一条仅特异作用于TGF-β引起的纤维化而不影响其他免疫活性作用发挥的新途径。有研究证实，TGF-β2能够刺激HTF产生CTGF[4]，但TGF-β2是否也具有相同的作用，这点在人体滤过泡的瘢痕化中仍未得到证实，因此，我们设计不同浓度的TGF-β2刺激的HTF细胞，看其是否能促进细胞的增殖，表达CTGF以及合成Fn，初步探讨CTGF在滤过泡瘢痕化中可能的作用。
1材料和方法
1.1材料 人重组TGF-β2蛋白（Peprotech，USA），鼠抗人Fn抗体（Santa cruz，USA），SP试剂盒（北京中杉），DAB试剂盒(武汉博士德)，羊抗人多克隆CTGF抗体（R&D,USA），羊抗兔二抗（武汉博士德），二甲基四氮唑盐（MTT）（Sigma，USA），二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，USA），Trizol Reagent (Invitrogen, USA)，逆转录及PCR试剂盒(Progrema,USA)。以青光眼滤过术中取下的人Tenon囊筋膜组织,采用组织块贴壁培养法[5]培养人Tenon囊成纤维细胞。取3～6代对数生长期HTF进行实验。
1.2方法 消化80%融合的细胞后，用含150g/L新生牛血清的DMEM培养液调成5×107/L细胞悬液，按100μL/孔接种于96孔板，24h后吸除培养液，分为空白对照组（无血清DMEM培养液）和6个处理组：分别为不同浓度的TGF-β2（0.5，1，2，4，5，10μg/L），诱导培养24h，每组设8个复孔。24h后加入MTT 20μL/孔，继续在CO2培养箱中培养4h后，弃去培养液，加入DMSO 150μL/孔，静置30min，在酶联免疫测定仪上测其在570/630nm处的吸光度值（A）。实验重复3次。另将细胞悬液1×108/L密度接种于放有盖玻片的6孔板中,贴壁24h后选用3个TGF-β2浓度组（T1 2μg/L，T2 4μg/L ，T3 5μg/L）及正常对照组（N组）（每组4片）分别加入各自不同的培养液共3mL，诱导24h后终止培养，用4℃ PBS漂洗3次，再放入4℃固定液（冷丙酮：无水乙醇＝1∶1的混合液）中固定15min，晾干后再按S-P法即用型试剂盒和DAB试剂盒说明书操作，鼠抗人Fn多克隆抗体稀释度1∶100，DAB显色2min，苏木素复染。PBS代替一抗作阴性对照。将每张片图像摄入机，通过HMIAS-2000高清晰度彩色医学图像分析系统，得出代表每张爬片阳性表达强弱的平均灰密度值（A），然后再进行统计学处理。实验重复3次。另收集各组（实验分组同上：T1，T2，T3，N共4组）培养瓶中的HTF，用Trizol Reagent裂解细胞，提取总RNA，于波长260，280nm处测定吸光度（A）值。逆转录反应条件为42℃ 1h，99℃ 5min，5℃ 5min，同时设无RNA的阴性对照。PCR反应引物设计应用Primer Premier 5.0软件，其内参照为β-actin。预期CTGF的扩增片断长度为292bp，上游引物为5′-TCTTCGGTGGTACGGTGTA -3′,下游引物为5′-ACCAGGCAGTTGGCTCTAA-3′;β-actin扩增片段长度为283bp,上游引物为5′-CTGTGGCATCCACGAAACT -3′,下游引物为5′- GGACTCGTCATACTCCTGCTT -3′。反应条件为: 95℃预变性3min，95℃变性30s，59℃退火40s，72℃延伸40s，共循环35次，72℃最后延伸7min。RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。电泳产物进行灰密度扫描，计算mRNA指数(mRNAindex, RI)。RI=CTGFmRNART-PCR产物扫描值β÷-actinmRNA RT-PCR产物扫描值,用以代表细胞中CTGF mRNA的相对含量。重复3次独立的RT - PCR全过程。
统计学处理：检测结果数据均以均数±标准差( )表示，统计采用SPSS12.0统计软件包，进行单因素方差分析，多重比较采用LSD检验法，P <0.05为差异有显著意义，P <0.01为差异有极显著意义。
2结果
人Tenon囊组织块贴壁法培养6d后即可见细胞自组织块边缘爬出，形态呈梭形或分枝状长多边形，胞体透明，逐渐融合并呈旋涡或放射状生长，生长旺盛，12d即融合并可传代，随着传代增加，分枝状形态细胞较多，甚至不加血清亦可见缓慢生长。TGF-β20.5μg/L，1μg/L浓度组的A值分别为0.212±0.018，0.233±0.021与正常对照组0.202±0.026无显著性差异，2μg/L，4μg/L，5μg/L组的A值分别为0.263±0.020，0.301±0.018，0.331±0.016，与对照组及相互之间差异有统计学意义，10μg/L组的A值为0.325±0.020与5μg/L组之间无显著性差异。Fn的阳性表达呈棕黄或棕褐色，位于细胞质内，胞核染为淡蓝色；正常对照组呈极弱阳性甚或阴性（图1A），随TGF-β2浓度的增加Fn的阳性表达呈增强趋势，图1B、1C分别为2μg/L、5μg/L的刺激组。3个处理组的A值分别为154.2±0.62，144.55±0.87，133.43±1.40与对照组162.38±3.14及各处理组间均有显著性差异。计算核酸纯度A260/280为1.8～2.0，说明RNA纯度较好；管家基因β-actin在4组细胞中的转录水平恒定,可以作为PCR产物相对定量标准；β-actin和CTGF分别在283bp及292bp位置上各出现一特异性条带,与预期扩增片断长度相符(图2，3)；CTGF-RI值依次为：1.062±0.013，0.988±0.011,0.938±0.010，0.878±0.008；各处理组均与正常对照组具有显著性差异,而且各处理组之间均具有显著性差异。
图1 A：正常对照组细胞；B：2μg/L TGF-β2刺激后细胞分泌Fn明显增多，位于胞质内，染棕黄或棕褐色；C：5μg/L TGF-β2刺激组
图2 各组的内参水平
图3 TGF-β2对HTF CTGFmRNA的影响
3讨论
青光眼滤过术后滤过泡的瘢痕化是手术失败的最主要原因。目前临床上常用的有：5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)、丝裂霉素C(mitomycin C, MMC)、环孢霉素A(cyclosporinA, CsA)等，主要是通过拮抗成纤维细胞的增殖而发挥作用，它们的应用明显地提高了滤过术的成功率[6,7]，但都是非特异性的，并且有可能伴随着严重的潜在并发症，如低压性黄斑病变，滤过泡渗漏，滤过泡感染，眼内炎以及对角膜的毒性反应等，所以寻求更加特异地抑制瘢痕形成的药物特别是滤过区可能出现的各种生长因子是近几年来人们研究的主要方向。
有研究表明，在机体创伤修复进程中起到最关键调控作用的细胞因子莫过于TGF-β[1]，与滤过手术联系最密切的则为TGF-β2。Esson等[8]发现，兔滤过术后5d在滤过泡组织内TGF-β2和CTGF均高表达,外源性的TGF-β2和CTGF的加入使有效滤过面积分别在术后3d和6d减少到50%。激活的TGF-β2可以与细胞表面的特异受体结合从而活化成纤维细胞的功能,增加其Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达并促进胶原合成和成熟,并影响细胞外基质内其它成分如纤维连接蛋白、弹性蛋白、蛋白多糖和基质金属蛋白酶及其抑制物等的mRNA转录[9]。本实验设计不同浓度TGF-β2[10]刺激HTF，结果显示，其在2μg/L到5μg/L之间有剂量依赖性地促进HTF的增殖和合成纤维连接蛋白的趋势，与以往的研究结果[7]相符合。其中5μg/L与10μg/L之间无统计学差异，表明5μg/L已经使相应的受体达到饱和。
CTGF是继TGF-β2之后发现的又一个重要的促纤维化因子，被认为是TGF-β的下游作用元件以及纤维化进程的启动因子，是TGF-β激活成纤维细胞后由其分泌并作为TGF-β的下游效应介质作用于结缔组织细胞后刺激细胞的增殖和ECM的合成[2]。根据CTGF作用的部位不同,它可显示出不同的生物学效应,但主要表现为促进细胞有丝分裂和增生、趋化细胞、诱导细胞粘附、促进细胞外基质(ECM)的合成[3]。本实验显示，生理状态下CTGF的表达水平很低，而在TGF-β2的刺激下其mRNA的表达明显升高，推测CTGF生物学效应相对较小，仅介导了TGF-β的促纤维化效应。Duncan等[11]在体外细胞培养实验中,应用特异性抗CTGF抗体或CTGF反义寡核苷酸探针,可有效抑制TGF-β诱导肾小管成纤维细胞增生和胶原的合成。尽管在体外和体内实验中已经证实TGF-β2的单克隆抗体能够提高高危患者功能滤过泡形成率和维持存活[12]，但是由于其具有高效的抑制免疫、抑制炎症、抑制上皮细胞增殖等负面效应,长期抑制TGF-β2的作用可能给机体带来不利影响,严重的如免疫调节失控引起机体的自身免疫性疾病[13]。所以作为纤维化性疾病发生过程中的关键介质,CTGF有可能为防治滤过泡瘢痕形成提供一个更理想的特异性靶点。
【】
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