FLIP、NF-κB在胃癌中的表达及相关性研究

【摘要】  ［目的］ 研究FLIP、NF-κB在胃癌及癌前病变中的表达及两者之间的关系。 ［方法］ 运用免疫组织化学染色SP法检测FLIP、NF-κB在45例胃癌与60例癌前病变组织中的表达。［结果］ 胃癌FLIP、NF-κB蛋白阳性表达分别为82.2%（37/45）、62.2%（28/45），明显高于肠化生的30.0%（9/30）、23.3%（7/30）（P＜0.01），与异型增生40.0%（12/30）、33.3%（10/30）（P＜0.01）。FLIP表达与胃癌临床分期及淋巴结转移相关，与肿瘤分化程度无明显相关性；NF-κB表达与胃癌分化程度、临床分期及淋巴结转移相关（P＜0.05）。NF-κB与FLIP呈正相关(r=0.52，P＜0.05)。［结论］ FLIP与NF-κB异常表达与胃癌的发生及预后密切相关；NF-κB与FLIP在胃癌形成中可能起协同作用。

【关键词】  胃肿瘤

    A Study of Relationship between Nuclear Factor KappaB(NF-κB) and FLICE-inhibitory Protein(FLIP) Expression and Gastric Carcinoma 

       Abstract: ［Purpose］ To explore the relationship of FLICE (FADD (Fas-associated death domain)-like IL-1beta-converting enzyme )-inhibitory protein (FLIP) and NF-κB expression and gastric carcinoma and precancerous lesions. ［Methods］ Expression of FLIP and NF-κB in 45 cases with gastric carcinoma and 60 cases with precancerous lesion was detected by immunohistochemical method (SP method). ［Results］ Positive expression of  FLIP and NF-κB in gastric carcinoma was  82.2%（37/45） and 62.2%（28/45）; in intestinal metaplasia, 30.0%（9/30） and 23.3%（7/30）; and in dysplasia, 40.0%（12/30） and 33.3%（10/30） respectively with significant difference （P＜0.01）. Expression of FLIP correlated with clinical staging and lymph node metastasis, not with differentiation degree in gastric carcinoma. Expression of  NF-κB correlated with differentiation degree, clinical staging and lymph node metastasis in gastric carcinoma（P＜0.05）. There was a positive correlation between FLIP and NF-κB (r=0.52，P＜0.05）. ［Conclusion］ Abnormal expression of FLIP and NF-κB closely correlates with gastric carcinogenesis and prognosis. NF-κB and FLIP may play a synergistic role in gastric carcinogenesis.

    Key words: gastric neoplasms; FLICE-inhibitory protein; nuclear factor-kappaB

    Fas相关死亡区域蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白(FLICE-inhibitory protein，FLIP)是近年来发现的一类含有死亡结构（death effect domains，DED）的凋亡抑制蛋白，研究发现FLIP异常表达与许多恶性肿瘤发生发展相关。核因子-κB是一种具有多向调节功能的转录因子，参与许多基因的转录调控。近年来研究发现它可能在肿瘤的发生发展中具有重要作用。关于FLIP与NF-κB在胃癌及癌前病变中表达相关性的研究国内少有报道。我们运用免疫组化研究FLIP、NF-κB在胃癌与癌前病变中的表达及其相关性，以探讨其在胃癌发生、发展中的可能作用。

    1   材料与方法

    1.1   一般资料

    45例胃癌和60例癌前病变组织分别来自南华大学附属二2002年6月~2004年6月手术切除与胃镜下活检标本，胃癌患者术前均未行放、化疗，术后均经病理确诊。胃癌患者男性28例，女性17例，年龄34岁~76岁，中位年龄54.6岁。按全国胃癌协作组病理组制定的方案：其中早期胃癌12例，进展期33例；高中分化32例，低分化和未分化23例；淋巴结转移者30例，无淋巴结转移者15例。中重度异型增生与中重度肠化生各30例，男性35例，女性25例；年龄28岁~74岁，中位年龄55.4岁。

    1.2   试剂与仪器 

    兔抗FLIP多克隆抗体（Cat.#-1552）购于NeoMarkers公司。超敏SP试剂盒（Kit-9710）、即用型兔抗NF-kappaB多克隆抗体 (RAB-0531)及DAB显色试剂盒购于福建迈新生物工程公司。

    1.3   方   法 

    石蜡切片常规脱蜡水化，柠檬酸盐缓冲液煮沸抗原修复，FLIP工作液浓度1∶150，NF-κB为即用型，免疫组化按照SP检测试剂盒说明进行，所有样本均设阴性对照（以磷酸盐缓冲液替代一抗）。

    1.4   判定标准 

    FLIP阳性为胞质染成黄色或棕黄色，NF-κB阳性为胞质与胞核均染成黄色或棕黄色，以胞质为主，每张切片随机选取5个高倍视野，参照相关[1]，FLIP阳性率≥30%为阳性，阳性率＜30%为阴性；NF-κB阳性率＜5%为阴性，≥5%为阳性（＋）。FLIP、NF-κB表达半定量分析采用BLTDMC-2080病理图文分析系统，显微镜下每张切片摄取10个高倍视野，输入分析系统内，FLIP、NF-κB的表达强弱（以光密度值A值表示）。

    1.5   统计学处理

    采用统计软件SPSS10.0，两样本率比较用χ2检验，两因素的相关分析用直线相关分析(Pearson相关系数)，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

    2   结   果

    2.1   胃癌与癌前病变组织中FLIP、NF-κB阳性表达率

    FLIP蛋白呈棕黄色细颗粒，定位于细胞质，胃癌组织染色阳性细胞成团分布，癌前病变组织FLIP染色浅。NF-κB阳性染色见于胞核与胞质，但以胞质为主，从癌前病变到胃癌组织，胞核阳性染色强度逐渐增强。胃癌组织中FLIP、NF-κB阳性表达率分别为82.2%（37/45）、62.2%（28/45），异型增生与肠化生阳性表达率分别为40.0%（12/30）、33.3%（10/30）与30.0%（9/30）、23.3%（7/30），胃癌组与癌前病变组之间差异有统计学意义（P值均＜0.01）。

    2.2   FLIP、NF-κB表达与胃癌临床病理特征关系

    胃癌进展期与淋巴结转移者FLIP阳性表达率分别为90.9%（30/33）和93.3%（28/30），明显高于早期与无淋巴结转移者，其阳性表达率分别为58.3%（7/12）和60.0%（9/15），差异有统计学意义（P＜0.01），而与癌细胞分化程度及年龄、性别、肿瘤大小无相关性（P＞0.05）。

    NF-κB阳性表达率在进展期胃癌、淋巴结转移组及低分化胃癌组分别为72.7%（24/33）、73.3%（22/30）和71.9%（23/32），明显高于早期、无淋巴结转移及高分化胃癌组，其阳性表达率分别为33.3%（4/12）、40.0%（6/15）和38.5%（5/13），差异有统计学意义（P＜0.05），而与年龄、性别及肿瘤大小无相关性（见表1）。

    2.3   胃癌组织NF-κB与FLIP蛋白表达关系

    两者表达相关性分析显示，37例FLIP蛋白表达阳性者中，NF-κB p65蛋白表达阳性例数为27例，8例FLIP蛋白表达阴性者中，NF-κB p65蛋白阳性例数为1例。经机自动测量并计算阳性表达平均光密度值（A值）得：NF-κB p65蛋白在胃癌中表达的光密度值为0.26±0.04，FLIP蛋白在胃癌中表达的光密度值（A值）为0.27±0.08。经Pearson相关分析显示两者表达呈正相关（r=0.52，P＜0.05）。

    3   讨   论

    胃癌的发生是一个多基因、多阶段、渐进性进行的复杂过程，细胞凋亡、增殖调控异常参与肿瘤的发生和。FLIP是近年来发现的一类含有DED的凋亡抑制蛋白，先前的研究已证实FLIP与许多恶性肿瘤如食管癌、大肠癌和肺癌等发生、发展密切相关，且把FLIP的表达水平作为病程进展指标之一，并且把它作为一种新的肿瘤预后因素[2，3]。本研究结果显示：①胃癌中FLIP阳性表达率为82.2%，与国外相关报道基本一致[1]，但表达率略偏低，可能与所选标本有一些相对早期胃癌的关系。从肠化生（30.0%）至异型增生（40.0%），其表达率呈上升趋势，这种表达率递增与胃癌的演变发展过程相符合。②进展期胃癌中FLIP阳性表达率（90%）明显高于早期胃癌（58.3%），提示FLIP表达可能与胃癌的临床进展有关，但未发现其表达与胃癌的分化程度有关，这与FLIP在非小细胞肺癌表达研究一致[4]。伴淋巴结转移和（或）血行转移的胃癌组织，其FLIP阳性表达率与表达强度明显高于无淋巴结转移（60%）或血行转移者。而FLIP阳性表达率与年龄及肿瘤大小均无关（P＞0.05），由此可见，FLIP高表达与肿瘤转移密切相关，表达率越高提示预后越差，可作为胃癌患者预后指标之一。

    NF-κB是一类具有多向性转录调节功能的核蛋白因子，通常由p50和p65组成异源二聚体。当受到细胞因子等刺激时NF-κB进入胞核，与NF-κB位点结合，启动靶基因转录，诱导相关基因表达。近年来研究发现许多肿瘤中可见NF-κB异常活化[5]，且研究表明NF-κB在细胞增殖与凋亡中具有核心作用[6]。

    我们的研究中NF-κB亚单位p65蛋白阳性表达位于胞质和胞核，以胞质为主，这与p65蛋白具有失活和活化两种状态相一致，其核内表达水平可间接反应其活性。实验结果显示，胃癌组NF-κB p65表达（62.2%）明显增强，与肠化生（23.3%）、异型增生（30%）组相比具有显著性差异（P<0.05），提示其异常表达可能在胃癌发生发展过程中起作用，其表达上调是胃癌发生中的早期分子事件。低分化和未分化（71.9%）、进展期（72.7%）、有淋巴结（73.3%）及血行转移胃癌其NF-κB p65阳性表达率显著高于高中分化（38.5%）、早期（33.3%）及无淋巴结（40%）血行转移组（P<0.05），这表明NF-κB p65表达随肿瘤恶性度增加、临床分期越晚而增加，因而其表达水平可间接反映胃癌的恶性程度及患者预后。关于NF-κB致癌机制，目前倾向于通过上调抗凋亡基因[7]或诱导TRAF和IAP等而拮抗凋亡，亦可通过调节肿瘤细胞增殖或通过上调细胞周期蛋白等表达促进肿瘤的发生、发展。

    关于NF-κB与FLIP在胃癌及癌前病变中的表达及其相关性尚少有报道，有研究认为NF-κB的异常表达与活化可诱导FLIP的表达，而FLIP在NF-κB抗凋亡过程中起着重要作用[8，9]。Okano等[10]在研究肝细胞癌时发现 c-FLIP的过表达可激活NF-κB，而c-FLIP表达下调可减弱TNF-α等诱导的NF-κB的活化。我们的实验发现，在胃癌形成过程中FLIP与NF-κB p65表达之间存在着一定的正相关关系（r=0.52，P<0.05），表明两者在胃癌发生发展中可能存在协同作用，共同参与胃癌的形成。

【】
  [1] Lee SH, Kim HS, Kim SY, et al. Increased expression of FLIP, an inhibitor of Fas-mediated apoptosis, in stomach cancer [J]. APMIS, 2003, 111(2):309-314．

[2] Djerbi M, Screpanti V, Catrina AI, et al. The inhibitor of death receptors signaling, FLICE-inhibitory protein defines a new class of tumor progression factors[J]. J Exp Med,1999,190(7):1025-1032．

[3] 高思海, 潘铁成, 赵金平, 等． 食道鳞癌FLIP表达与细胞凋亡相关[J]．世界华人消化杂志,2004,12（6）:1470-1473.

[4] 曹勇, 李清泉, 钟立厚, 等． FLIP在非小细胞肺癌中的表达及其与细胞凋亡的关系[J]． 肺癌杂志, 2003, 6（1）:51-54．

[5] Sasaki N, Morisaki T, Hasshizume K, et al. Nuclear factor-κB p65(RelA) transcription factor is constitutively activated in human gastric carcinoma tissue[J]. Clin Cancer Res, 2001, 7（12）:4136-4142.

[6] Aggarwal BB. Nuclear factor-kappaB: the enemy within[J]. Cancer Cell, 2004, 6(3):203-208.

[7] Wang CY, Guttridge DC, Mayo MW, et al. NF-kappaB induces expression of the Bcl-2 homologue A1/Bfl-1 to preferentially suppress chemotherapy-induced apoptosis[J]. Mol Cell Biol, 1999, 19(9):5923-5929.

[8] Micheau O, Lens S, Gaide O, et al. NF-kappaB signals induces the expression of c-FLIP[J]. Mol Cell Biol, 2001, 21(16):5299-5305.

[9] Kreuz S, Siegmund D, Scheurich P, et al. NF-kappaB inducers up regulate c-FLIP, a cycloheximide-sensitive inhibitor of death receptor signaling[J]. Mol Cell Biol, 2001, 21(12):3964-3973.

[10] Okano H, Shiraki K, Inoue H，et al. Cellular FLICE/caspase-8-inhibitory protein as a principal regulator of cell death and survival in human hepatocellular carcinoma[J]. Lab Invest, 2003, 83(7):1033-1043.