脑肿瘤干细胞研究进展
【摘要】 越来越多的研究显示，肿瘤组织中只有少部分细胞具有无限增殖和自我更新的能力，这些细胞与干细胞类似，是肿瘤发生的基础，即肿瘤干细胞。这类细胞的特征是自我更新能力失去控制。肿瘤干细胞已经从几种实体瘤中被分离出来，近期有关胶质细胞瘤和小脑髓母细胞瘤的研究已经证实其中含有上述干细胞样肿瘤细胞。本文就近年关于脑肿瘤干细胞概念的提出、鉴定、来源、与神经干细胞的差异及对脑肿瘤的启示进行讨论，以期为脑肿瘤的发生和治疗提供依据。
【关键词】 肿瘤干细胞
作为神经系统常见病，人高级别胶质瘤具有极强的侵袭能力，显微镜下显示其恶性细胞大大超出经造影剂强化的影像学边界，甚至可以在瘤边界以外7cm处发现。这种生物学特征使先进的脑功能显像技术难以达到理想的敏感性和特异性，而以此为支撑手段的微创神经外科技术和三维适形放疗技术也因此失去它们在治疗其它疾病的良好疗效。新近统计结果显示，经过综合治疗间变性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤中位生存期分别只有18个月和12个月。为提高疗效，人们对其生物学特征进行了深入研究，2003年Sing[1]从脑肿瘤组织中分离到脑肿瘤干细胞(brain tumor stem cell，BTSC)，这种新的研究视角必将对胶质瘤的治疗产生深远的影响。
1 BTSC提出的基础
BTSC的概念是在神经干细胞(neural stem cell，NSC)研究取得一定成果的基础上提出来的。长期以来，人们认为成年后中枢神经系统由成熟的终末分化细胞构成，很难或不能再进行分裂和增殖。1992年Reynolds[2]从成年小鼠纹状体中分离到能够不断增殖、具有多向分化潜能的细胞，并提出了NSC的概念，其后人们又陆续在哺乳动物及人的不同脑区体外分离到了NSC，说明成熟的中枢神经系统确实具有神经再生的潜能。
个别肿瘤干细胞的分离鉴定成功是BTSC提出的另一个前提。白血病的相关研究最先提供证据：Bonnet等[3]报道人类急性髓系白血病起源于原始造血细胞的一个异质群体，它们能在糖尿病免疫缺陷鼠（SOD/SCID鼠）中发生人类白血病，而该细胞群大部分具有与造血干细胞相同的表型，即CD34+CD38-，相反CD34+CD38+表型的白血病细胞绝大多数不能形成人类白血病。这使人联想到白血病具有类似造血干细胞的特殊群体。最早从实体瘤中分离鉴定出肿瘤干细胞的报道来自Muhammad研究小组[4]，他们从乳腺癌中分离鉴定出一类表型特异的小比例细胞群，即ESA+CD44+CD24-/lowLin-。将少至100个此类细胞注射到NOD/ SCID 小鼠皮下乳房垫上即可生成与人原发乳腺癌相似的肿瘤。这群成瘤能力极强的细胞被称为乳腺癌起始细胞。该研究还显示，成瘤细胞和非成瘤细胞的细胞周期分布相似，从形态学上也无明显差异，故肿瘤干细胞表面的分子标志对于其鉴别具有更重要的意义。
2 BTSC的鉴定
证实脑肿瘤具有干细胞的关键问题是找出特异的分子标记，并以此筛选出强致瘤能力的细胞群——肿瘤干细胞。在这方面，Singh 迈出了关键一步。他们以CD133标记分离的脑瘤病人肿瘤细胞，CD133为跨膜蛋白，定位于细胞膜及细胞浆，其表达起始于神经胚胎形成时，随着NSC分化为神经元和胶质细胞而停止表达。观察发现， CD133阳性组分在多形性胶质母细胞瘤中占19%～29%，在髓母细胞瘤中占6%～21%，而这一比例与神经球形成实验的结果具有很好的相关性。将CD133阳性球体分离成单个细胞以不同数目接种于小鼠脑内，即形成肿块并呈浸润性生长。更为特别的是，少至100个这样的细胞即可导致脑瘤形成并连续传代。免疫组化显示，CD133阳性肿瘤细胞同时表达神经前体细胞标志nestin和vimentin。该研究显示，脑肿瘤细胞中存在与正常脑组织类似的等级现象，具有干细胞特征的少数细胞是胶质瘤发展的基础，而CD133是这类细胞的有效鉴别标记。
Galli[5]以原发胶质瘤和髓母细胞瘤术后标本为研究对象，以胎儿NSC作为对照，也发现在高级别胶质瘤及髓母细胞瘤都产生了与NSC同样的神经球，其形成率在胶质瘤为0.5%～31%，在髓母细胞瘤为50%～80%。分离神经球行无血清培养，其中高级别胶质瘤经长期传代形成稳定细胞系。值得注意的是此细胞系中的单个细胞即能够形成克隆。将上述细胞系培养液中的EGF和FGF2去除，加入白血病抑制因子以诱导分化，随后的免疫组化显示细胞带有神经元和神经胶质细胞标记。可见，在高级别胶质瘤及髓母细胞瘤都存在一定比例的干细胞样肿瘤细胞，该类细胞具有很强的自我更新能力，而在分化培养条件下又显示出多向分化能力。同年Yuan[6]也报道了针对胶质母细胞进行的类似体内外实验，并得出相似的结果。
一系列实验结果表明：大部分脑肿瘤细胞失去自我更新和增殖能力，构成肿瘤的表型特征；小部分脑肿瘤细胞具备了正常NSC的自我更新、多向分化能力，而经系列传代及原位接种仍保持其生物学特性。这说明脑肿瘤中确实存干细胞，而CD133可以作为鉴定BTSC的特异分子标记。
3 BTSC的来源
目前多数肿瘤病因学理论都假设细胞分子遗传改变是肿瘤发生的原因。随着BTSC被分离鉴定和NSC研究逐渐深入，人们发现BTSC不只是在分离、扩增、分化和鉴定指标等方面与NSC类同，而且两者在发生学上可能存在渊源关系。
室管膜下区位于侧脑室外侧壁，是一层待分化细胞，即使到成年，仍持续保持神经元增殖分化的潜能，能够不断产生神经母细胞；同时形成吻侧迁移流，迁移到嗅球，替代其中不断更新的中间神经元。有人提出富集于该区的Nestin阳性细胞即NSC，而早在上世纪三四十年代，就有学者提出脑胶质瘤源于室管膜下区的胶质细胞，这使人想到脑肿瘤发生于正常的NSC。据此，Recht等[7]利用ENU(N-乙基-N-亚硝基脲)致瘤模型，并选择Nestin为标记物进行胶质瘤起源细胞的研究。结果发现，幼鼠出生后最早30d即可在室管膜下区附近的脑实质中出现单个或成团的Nestin阳性细胞；随着时间的延长，Nestin阳性细胞团逐渐增大，最终形成实体瘤，而对照组相同部位未发现Nestin阳性细胞及肿瘤发生。
其实，在更早的时间就有人证实NSC具有潜在的致瘤性。Holland等[8]将致癌基因Ras和Akt联合转入小鼠星形细胞和神经前体细胞，结果在后者成功诱发神经胶质瘤。这说明，分化终末期的星形细胞致瘤性减小，而畸变的NSC更易于发生恶变。有学者向小鼠脑内注入携带shh和c-Myc的逆转录病毒，结果在其表达的NSC上也成功诱发髓母细胞瘤[9]。
脑肿瘤源于正常的NSC另外的理论基础是两者具有共同的分化增殖调控通路，前者的发生常常与后者信号通路蛋白的异常表达有关。Shh(Sonic hedgehog)通路、PTEN(phosphotase and tensin homologue deleted on chromosome ten)基因、Wnt的下游基因β-catenin、多聚体转录因子Bmi-1等在保持NSC的自我更新能力中起重要作用。研究表明Shh信号的异常活化依次通过抑癌基因Rb失活和原癌基因n-myc激活促进易感神经祖细胞发展成髓母细胞瘤[10]；在髓母细胞瘤和其它脑肿瘤中β-catenin发生突变[11]，而Bmi-1表达增加[12]。PTEN编码一个调节NSC增殖的磷酸酶，在恶性胶质瘤中是最普遍的基因突变[13]。上述共同通路仅能说明正常干细胞和肿瘤干细胞有着不可分割的渊源关系，但不足以说明正常干细胞就是肿瘤干细胞的起源细胞，要确认肿瘤干细胞的来源还需要更多的直接证据。
近年来，由干细胞和出现一组肿瘤相关基因突变的细胞发生融合而成为肿瘤起源细胞的学说正在形成。该理论认为，在人的成神经管瘤和多形性胶质母细胞瘤的肿瘤干细胞中观察到染色体的紊乱可能是由细胞融合引起的[14]。它解释了肿瘤发生早期——并不一定要后期才出现的染色体紊乱现象，而成熟细胞也可通过细胞融合得到去分化机会并重新获得自我更新能力。总的来说，细胞融合后的去分化或转分化在肿瘤发生的起动、形成和进展期均可发生，但目前仍不清楚干细胞融合理论在肿瘤发生和发展中起到多大的作用。
4 BTSC与NSC的差异
在目前阶段，正常干细胞和肿瘤干细胞的相似性研究占主要地位，但肿瘤学家们最终的任务是确认两者的差异。Singh[1]和Galli[5]都注意到，在所有多形性胶质母细胞瘤分化培养基中一细胞同时具有神经元和胶质细胞标志，而这一现象从未在正常胎儿NSC中出现。令人感兴趣的是，这种双标记细胞在各种胶质瘤细胞中比例不同，其数量与增殖力指数具有相关性。Yuan[6]也发现，充分诱导分化从神经球分离的BTSC，然后转到NSC增殖条件下继续培养，结果这些单个细胞又能重新生成神经小球，而正常NSC则失去这样的能力。
Singh针对上述现象的解释是，肿瘤干细胞错误的分化程序被激活。Galli 对BTSC核型进行了分析，发现在各种细胞中普遍存在染色体数目和结构畸变，同时非整倍体频繁发生。而在正常NSC却不存在这种变化。特别的是，上述细胞的染色体畸变在长期培养条件下仍然保持不变。与正常细胞不同，在几乎所有的肿瘤中都发现非整倍体和染色体数目改变，近期的研究显示染色体过客蛋白的表达调节紊乱是其发生原因之一[15]。细胞恶性转化进而形成永生表型往往与端粒维持机制有关[16]，Galli的研究也显示出BTSC的端粒酶逆转录酶高度表达。总之，BTSC经诱导分化后的逆分化机制尚不明确，其可能原因是染色体不稳定及相关调节蛋白表达失调。
5 对胶质瘤的启示
肿瘤干细胞学说认为肿瘤为非均质群体，其中占少数的干细胞是复发转移的根源。为此，人们对这部分细胞与临床治疗相关的生物学特性进行了深入研究。Liu有关胶质瘤病例耐药的报告显示，在含有替莫唑胺、卡铂、Vp-16和泰素的培养液中CD133阳性细胞较阴性细胞具有更高的活性。耐药基因表达分析显示，CD133阳性细胞与阴性细胞相比，耐药基因（BCRP1和MGMT）和抗凋亡基因（FLIP、Bcl-2和 Bcl-XL）均有显著性升高[17]。研究证实了BTSC对细胞毒药物具有更高的耐药性，也为脑肿瘤较差的化疗疗效提供理论依据，同时强调逆转干细胞耐药对提供脑瘤化疗疗效具有重要作用。
细胞对DNA损伤做出应答的一个重要过程是检查点活化，当细胞受到照射时检查点激酶CHK1和CHK2使关键蛋白磷酸化，从而阻止正常的细胞周期进行。受到有关间充质干细胞放射敏感性研究的启示[18]，Bao[19]以胶质瘤病人标本和人胶质瘤异种移植物为对象，检测肿瘤干细胞放射敏感性。结果显示，CD133阳性细胞较阴性细胞放射敏感性显著降低，原因是前者更早活化DNA损伤检测点，并且高效修复射线所致损伤。实验进一步采用CHK1和CHK2特异抑制剂，结果明显提高肿瘤干细胞的放射敏感性。该研究从肿瘤干细胞角度分析胶质瘤辐射耐受的产生机理，为脑瘤放疗生物靶区理论提供了有力证据。
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)广泛分布于人体多种细胞和组织，调节细胞分裂、凋亡、迁移和分化，进而参与全身多种器官的发育和形成过程[20~23]。其基因表达异常和突变将导致胚胎死亡、组织器官发育异常。来自约翰·霍普金斯和米兰大学的家用骨形态发生蛋白4 (BMP4)预处理人恶性胶质瘤细胞，把这些处理细胞注射到小鼠脑内，结果未见肿瘤生长，而对照组可见大片浸润性癌肿生长。随后他们将含有缓慢释放BMP4的粒子直接送达植入恶性胶质瘤细胞的小鼠脑内，发现与对照组相比小鼠生存时间显著延长[24]。证实上述抗瘤作用源于 BMP4与肿瘤干细胞上的受体结合后激发Smad 信号通路，进而阻止后者的分裂能力。利用BTSC与干细胞的相似性，抑制其分裂增生能力，进而控制肿瘤，上述研究对脑瘤治疗具有很好的启示作用。类似的研究也见于Aguado的最新报道[25]：已知大麻可通过诱导转化细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成产生抗胶质瘤作用，Aguado以多形性胶质瘤活检组织分离得到的细胞和具有大麻受体的U87MG、U373MG细胞为对象研究大麻的抗肿瘤干细胞作用。结果发现，大麻在体内阻止干细胞增殖、诱导分化，在体外减少神经球形成。研究显示，大麻受体激活后可改变BTSC增殖分化的基因表达，通过加速分化抑制胶质瘤形成。
BTSC理论的提出有着重要意义，使临床脑肿瘤治疗更加具有针对性的同时，也为广为关注肿瘤发生问题提供依据。另外，BTSC与NSC属性上的相似，暗示着BTSC与NSC可能存在着某种必然的联系，对BTSC的研究也必将推动对NSC的研究。
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