高、低淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株抑制性消减杂交文库的构建
作者：崔晓楠，唐建武，侯力，宋波，班丽英
【摘要】 应用抑制性消减杂交(suppression subtracted hybridization，SSH)技术，分别构建2个不同淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株的SSH文库，高转移文库以高转移能力细胞株Hca-F为检测子（tester），同源的低转移能力细胞株Hca-P为驱赶子（driver）；低转移文库则相反。随机筛选2个文库阳性克隆进行测序,并在GenBank数据库中进行同源性比较。成功构建高、低淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株SSH文库，高、低转移文库中分别包含995个及967个阳性克隆；其中，95％的阳性克隆含有300bp~1 000bp不等的插入片段；随机测序显示，文库中含有已知的基因、ESTs及与任何序列无同源性的新基因片段。
【关键词】 抑制性消减杂交技术 肝肿瘤
肿瘤转移为多基因事件，已克隆鉴定的转移相关基因远不能揭示作用在恶性肿瘤转移各个阶段的分子信息，因此高通量筛选肿瘤转移相关基因成为研究肿瘤转移机制的主要平台。Hca-P和Hca-F是一对来自同一小鼠肝癌细胞克隆的不同亚克隆，经615小鼠局部皮下注射后，特异地向引流淋巴结转移，Hca-P为低转移株，转移率<30%，Hca-F为高转移细胞株，转移率>80%[1]。两株细胞为同一亲本，具有基本相同的遗传背景，稳定特异地向淋巴结转移，两者的差异集中于转移表型上，其差异表达的基因片段可能与肿瘤淋巴道转移相关。本实验应用ＳＳＨ技术，分别构建2个不同淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株的SSH文库，其中，高转移文库以高转移能力细胞株Hca-F为检测子（tester），同源的低转移能力细胞株Hca-P为驱赶子（driver），文库可能富集了肿瘤淋巴道转移基因; 低转移文库则以低转移能力细胞株Hca-P为tester，同源的高转移能力细胞株Hca-F为driver，文库可能富集了肿瘤淋巴道转移抑制基因，为高通量筛选肿瘤淋巴道转移相关基因奠定基础。
1 材料与方法
1.1 动物和细胞系
小鼠肝癌细胞系Hca-P和Hca-F[1]由本实验室自建并冻存。615近交系小鼠由本实验室繁育(辽实动质字（2000）028号)。
1.2 Hca-P和Hca-F细胞淋巴结转移率的鉴定
Hca-P和Hca-F细胞以2×106/只（约0.1ml细胞悬液）的剂量分别接种于30只615小鼠的足垫部皮下，于荷瘤28天后处死动物，取出局部瘤和引流淋巴结，石蜡包埋后进行常规HE染色，观察其淋巴结转移率。
1.3 Hca-P和Hca-F细胞总RNA的提取
采用TRIZOLTM(GIBCOBRL公司)试剂，分别提取Hca-P和Hca-F第二代培养细胞（各量约107个）总RNA，应用oligotex mRNA spin column purification kit (Qiagen公司)从两细胞株总RNA中分离mRNA。操作依照说明进行。经琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计鉴定质量及纯度。
1.4 dscDNA合成及限制性内切酶RsaⅠ消化
分别以 Hca-P和Hca-F mRNA (2μｇ)为模板合成dscDNA；Chroma spin-400 columns(Clontech，USA)纯化产物，限制性内切酶RsaⅠ消化dscDNA。
1.5 抑制性消减杂交(SSH)
高转移文库以Hca-F dscDNA作为tester，以Hca-P dscDNA作为driver；低转移文库以Hca-P dscDNA作为tester，以Hca-F dscDNA作为driver。采用PCR selectTM cDNA subtraction kit(Clontech公司)进行tester与driver之间的SSH，实验依照说明书进行。①2个文库tester dscDNA 6倍稀释，取等量分别与接头1、2连接；连接产物分别以G3PDH 3′primer, PCR primer 1及G3PDH 3′primer, G3PDH 5′primer为引物，检测连接效率。②连有接头1、2的tester分别加入过量的driver cDNA 68℃杂交8h，再合并2份杂交产物并加入新鲜变性的过量的driver cDNA 68℃杂交16h。杂交产物经过LA Taq DNA聚合酶补平末端后，以试剂盒提供的PCR Primer 1作为第一次PCR的引物，以Nested Primer 1 和Nested Primer 2R作为第二次PCR的引物，通过抑制性PCR富集差异表达基因的cDNA。
1.6 消减效率分析
分别以消减产物及未消减样品为模板扩增看家基因G3PDH（特异引物序列5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′;5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′）：94℃30ｓ、60℃30ｓ、72℃2ｍｉｎ，于第18、25、28、33个循环时各取PCR产物5μｌ电泳，分析消减效率。
1.7 消减杂交文库的建立及转化重组子的鉴定
取SSH获得的差异cDNA片段特异性PCR产物2μl与pT Adv 载体(CLONTECH公司)50ng连接，转化大肠杆菌DH5α，建立消减cDNA文库，依照克隆试剂盒推荐程序操作。取300μｌ菌液接种于含50μｇ/ｍｌ氨苄青霉素的LB/x-gal/IPTG琼脂板上，37℃孵育20ｈ，蓝白筛选阳性重组子, 应用差异cDNA片段接头序列的巢式引物进行PCR扩增鉴定重组质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测是否有插入片段及其大小。
1.8 信息学分析
2个文库各随机选取15个具有插入片段阳性克隆进行扩增、质粒纯化、M13反向引物或T7启动子引物的延伸反应，然后用ABIPRISM377DNA自动测序仪测序。去除载体序列和巢式PCR引物序列，即为目的基因的序列，利用GenBank数据库进行同源性比较分析(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/)。
2 结 果
2.1 成瘤率及淋巴结转移率
Hca-P和Hca-F细胞种植瘤于接种后7天便可触及；28天后Hca-P细胞荷瘤鼠区域淋巴结转移率10%（3/30），Hca-F细胞荷瘤鼠区域淋巴结转移率为80%（24/30），各自具有差别稳定的淋巴结转移能力。
2．2 RNA和mRNA的定性分析
1％琼脂糖凝胶电泳检测表明，所提取的TotalRNA有清晰的28S和18S的条带，且28S∶18S>2∶1，表明RNA没有降解；吸光度A260/吸光度A280为1.9，证明TotalRNA的纯度优良。所获mRNA为分子量大小不等的云雾状阴影，说明提取的mRNA质优量足。
2.3 dscDNA RsaⅠ的酶切结果
Hca-P和Hca-F细胞的cDNA与RsaⅠ酶切后的Hca-F和Hca-P细胞的cDNA在1％琼脂糖凝胶上同时电泳，酶切后的cDNA片段明显小于酶切前的cDNA片段。
2.4 连接效率的分析
高转移文库中条带1、3强度大于条带2、4强度的1/4；低转移文库中条带5、7强度大于条带6、8强度的1/4，保证了两文库中削减杂交中tester中的分子信息。
2.5 消减产物巢式PCR扩增结果
如图1所示，在试剂盒提供的PCR阳性对照的消减cDNA样品中扩增出了清晰的条带，且分子量与试剂盒说明书中的描述一致。消减样本的巢式PCR产物相比于未消减样品(对照)琼脂糖凝胶电泳图谱分布明显不同，消减后的PCR产物与消减前的PCR产物相比，片段变小，亮度减弱，分子量分布相对集中，说明SSH消除了tester和driver间的共有序列，而保留并富集了仅在tester中存在的序列。
2.6 消减效率分析
通过对消减产物及未消减样品G3PDH的PCR分析表明，消减产物在循环数达33次才见扩增产物，而未消减样品在23次循环时即可见扩增产物(图2)。表明tester和driver中共有的表达水平较稳定的看家基因G3PDHcDNA已被有效消除，实验具有较高的消减效率。
2.7 文库的建立及转化重组子的鉴定
高转移文库共包含995个阳性克隆和118个阴性克隆；低转移文库共包含967个阳性克隆和113个阴性克隆。全部阳性克隆保存菌种。2个文库各随机选取200个阳性克隆提取质粒，应用差异cDNA片段接头序列的巢式引物进行PCR扩增鉴定重组质粒，1%琼脂糖凝胶上电泳检测，分别有189、181个阳性克隆具有300bp～1 000bp之间呈随机分布的插入片段，而空载质粒未见扩增信号。
2.8 生物信息学分析
2个文库各随机选取15个具有插入片段阳性克隆进行测序，去除载体序列和巢式PCR引物序列，即为目的基因的序列。除去完全相同(如:Clone10-3与Clone22-2)和互补序列,利用Genbank数据库进行同源性比较分析(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/)，高转移文库测序的15个差异表达cDNA片段中，有9个克隆源于8已知基因，4个克隆与鼠的EST高度同源，2个克隆为新的EST（表1）；低转移文库测序的15个差异表达cDNA片段中，有8个克隆源于8已知基因；4个克隆与鼠的EST高度同源，3个克隆为新的EST（表2）。2个文库均未发现G3PDH等看家基因。
3 讨 论
20世纪90年代肿瘤转移机制的研究进入了多基因时代，构造了转移相关基因调控下的多元体系，认为肿瘤转移表型的建立和转移过程的完成是诸多转移相关基因及其产物互动的结果。“表达遗传学”认为由于突变引起肿瘤演进的基因仅占所有基因的2%，而大量的肿瘤相关基因，是以表达激活或受阻的方式在肿瘤发生过程中起作用，因而高通量筛选不同转移表型肿瘤细胞间差异表达的基因对于认知肿瘤转移机制意义尤为深远。SSH技术于1996年问世，是目前相对成熟的高效筛选差异表达基因的方案，通过抑制性PCR、两轮消减杂交、较高的退火温度(66℃和68℃)和巢式PCR,使得差异表达的cDNA片段得到特异扩增, 由于利用了杂交二级动力学原理, 实现了高、低丰度序列浓度的均等化，从而使低丰度的差异表达基因也能有效地克隆[2，3]。目前食管癌[4]、大肠癌[5]、肝细胞癌[6]、卵巢恶性上皮性肿瘤[7]、肾细胞癌[8]、前列腺癌[9]等人类重要的常见恶性肿瘤与其起源正常组织之间的抑制性消减杂交文库已经相继被建立，并克隆鉴定了一批肿瘤相关基因，如黑色素瘤转移相关的KISS-1基因，与Wilm’s瘤发生相关的RBAP4P基因，以及乳腺癌相关的DEME-6基因等。Von Stein等通过研究转移性与非转移性的两种胰腺癌细胞Bsp73-ASML和Bsp73-1AS，有力地证明了SSH的真阳性率达94%，并认为检测每个克隆是否为假阳性已没有必要[2]。
目前肿瘤转移相关动物模型主要为血道转移模型，肿瘤转移的研究多以此为模型，所获转移相关结论，严格而论，均与血道转移相关。因缺乏特异的肿瘤淋巴道转移模型，明确的淋巴道转移相关基因还未见报道。哪些基因控制调控了肿瘤的淋巴道转移，淋巴道转移的机制与血道转移有何区别等都知之甚少。作为恶性上皮肿瘤早期转移的主要形式，淋巴道转移机制的解析对临床肿瘤转移的诊治有着更为积极的意义。
Hca-P和Hca-F为源于同一亲本的小鼠腹水型肝癌细胞亚克隆，具有基本相同的遗传背景，稳定特异地向淋巴结转移，两者的差异集中于转移表型上[1]，两者间差异表达的基因片段可能参与了肿瘤淋巴道转移的调控。
本实验应用SSH技术，分别构建2个不同淋巴道转移能力小鼠肝癌细胞株的SSH文库，其中，高转移文库以高转移能力细胞株Hca-F为tester, 同源的低转移能力细胞株Hca-P为driver，文库可能富集了肿瘤淋巴道转移基因; 低转移文库则以低转移能力细胞株Hca-P为tester，同源的高转移能力细胞株Hca-F为driver，文库可能富集了肿瘤淋巴道转移抑制基因，为高通量筛选肿瘤淋巴道转移相关基因奠定基础。
动物实验验证了Hca-F和Hca-P细胞具有差异稳定的淋巴结转移能力。提取的总RNA吸光度A260/吸光度A280为1.9，纯度较高，经1％琼脂糖凝胶电泳检测发现提取的RNA有清晰的28S和18S的条带，且28S∶18S>2∶1，说明RNA没有降解。所获mRNA为分子量大小不等的云雾状阴影，说明提取的mRNA质优量足。Hca-F和Hca-P细胞的cDNA与RsaⅠ酶切后的Hca-F和Hca-P细胞的cDNA在1％琼脂糖凝胶上同时电泳，发现酶切后的cDNA片段明显小于酶切前的cDNA片段，说明酶切较完全。连接效率>25%，保证了削减杂交中tester中的分子信息。两轮消减杂交后的产物经巢式PCR扩增出了分子量大小不等的产物，消减后的PCR产物与消减前的PCR产物相比，片段变小，亮度减弱。以看家基因G3PDH的序列设计引物，用PCR的方法进行消减效率检测，发现在未消减样品中于PCR反应25循环时即可看见特异性扩增带，而在消减后样品中于PCR反应35循环才看见特异扩增带，说明经过两轮消减tester和driver中共同表达的看家基因G3PDH的丰度大幅度下降，提示2个细胞株中共同表达的基因得到了有效的消减。2个文库均获得了约900余个克隆，对各库随机挑选的200个可能含差异表达cDNA片段的白色菌落进行菌液PCR扩增，发现95％的白色菌落中含有大小不等的插入片段，分子量主要分布在300bp~1 000bp。高质量的抑制性消减杂交文库的构建成功。
我们的工作不局限于对单一路径或几个生物学分子的研究，而是将恶性肿瘤转移作为立体动态的系统，建立了肿瘤转移相关文库，文库中的信息代表了不同转移能力肿瘤细胞表达的特质，进而为高通量筛选肿瘤淋巴道转移相关基因奠定基础。随机选取阳性克隆测序分析表明，2个文库含有转移相关基因、与肿瘤转移尚未建立关联的基因、功能未知的基因及与已知基因无同源性的基因片段（可能代表新基因），反映了转移调控的复杂性及我们对转移系统认知少之又少的现状，同时他们与肿瘤细胞转移表型建立的链接，为功能未知基因的功能研究提供了线索。胚胎基因高频率出现于2个文库中及胚胎基因AFP、CEA在肝癌及结肠癌中高水平表达，提示胚胎与肿瘤可能存在某种联系。转移过程的正性调控因子VEGF-C[10，11]、ezrin[12，13]、Hsp84[14，15]基因及负性调控因子TRF1、TRF2[16~18]及maspin[19~21]基因分别出现于高、低转移文库，表明2个文库对差异表达基因的有效富集作用，显示了文库筛选肿瘤转移相关的已知及新基因的可能性，为进一步克隆鉴定肿瘤转移相关基因奠定了基础。
【】
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