骨肉瘤动物模型的研究进展
【摘要】 实验动物模型是研究人类骨肉瘤的重要手段之一。动物模型有多种不同建立方法。全文对动物模型的建立方法、模型特点及目前应用等进行综述。
【关键词】 骨肉瘤
骨肉瘤好发于青少年，是导致青少年死亡的第二大恶性肿瘤。至今对骨肉瘤的病因及其转移机制仍了解甚少。可以通过肿瘤动物模型来对其进行进一步研究，目前常用的动物模型有小鼠、大鼠、兔、犬等。大鼠器官与人类相似，基因型与人类也相近。犬类可自发骨肉瘤，与人类有一定的相似，常用作自发性肿瘤模型。近来流行免疫抑制性或免疫缺陷性动物模型，如裸鼠等，可以接种不同来源的肿瘤细胞，从而在同一宿主研究比较。动物模型有助于探索骨肉瘤的发病机制，研究其转移的内在机制和评价疗效，对骨肉瘤的研究有重要价值。本文主要从骨肉瘤动物模型的建立方法、模型特点及具体应用等方面进行综述。
1 动物模型建立方法
1.1 诱发型肿瘤模型
系将致癌物质与动物特定部位直接或间接接触，使该部位靶器官产生肿瘤。其操作相对简单，靶器官和诱癌剂恒定，成瘤率较高，是一种较好的建立肿瘤模型的方法。但诱发肿瘤形成需要较长时间，且诱发肿瘤的恶性程度不高，低分化肿瘤少见。
物理因素诱导：放射性核素是强致癌物质，将核素与动物接触，可以诱发骨肉瘤。原子序数大于铀的核素，如238钚、351镅等是强致癌物。放射性核素诱导骨肉瘤可将核素的盐溶液注射到动物体内,也可直接用核素对动物进行照射。用核素盐溶液诱导肿瘤时，剂量应适宜，过低不易致瘤，过高时核素对肿瘤细胞有杀伤作用，会导致实验失败。王玉民等[1]以Wistar大鼠为研究对象，利用发射性超铀核素238钚作为物理致癌因子在大鼠体内诱发肿瘤。他们将硝酸238钚溶液释后，以不同剂量注射于大鼠臀肌内，发现随着盐溶液浓度的增加，骨肉瘤的发生率也随之上升，但当剂量增加到一定程度时，骨肉瘤的发生率反而下降。Tinkey PT等[2]以Sprague-Dawlev大鼠为研究对象，用60Ｃo以致瘤累积剂量照射其后腿4～8个月，观察到大剂量照射的大鼠发生了骨肉瘤及其他肿瘤，低剂量照射的大鼠则未发生肿瘤。研究者认为Sprague-Dawlev大鼠是一种可以通过局部照射建立骨肉瘤动物模型的优良品种。
化学因素诱导：是指将某些化学物质，如硅酸锌铍、氧化铍、甲基胆蒽，N-羟基，2-乙酰胺芴的铜蛰合物，二乙基亚硝胺，4-硝基喹啉-1-氧化物等，以一定的浓度定期注射到动物体内诱发肿瘤。该方法受多种因素影响，耗用时间长，诱导的肿瘤模型重复性低，且化学物质对研究者也有所伤害，所以目前已很少使用。
病毒诱导：随着分子生物学的进展，研究发现某些病毒有致癌作用，这类病毒被称为肿瘤病毒。病毒通过整合到宿主细胞基因组中，激活原癌基因，诱发肿瘤生成。常用于诱导产生骨肉瘤的病毒包括：猿空泡病毒40（SV40）、Moloney肉瘤病毒（Moloney sarcoma virus）、FBJ、RFB和FBR骨肉瘤病毒以及Poluma病毒等。SV40是一种双链环状DNA病毒，将SV40或SV40 DNA注射到新生的仓鼠体内可诱发骨肉瘤。Moloney骨肉瘤病毒诱导的肿瘤模型组织学类形与人类骨肉瘤相类似。FBJ、RFB和FBR骨肉瘤病毒均是RNA病毒，Finkel MP等[3]将去除了肿瘤细胞的提取物（含有病毒）注射到新生小鼠体内可以诱发骨肉瘤。病毒诱导肿瘤的效率较高。Olson HM等[4]用Moloney肉瘤病毒对新西兰黑大鼠进行诱导，肿瘤发生率约在80％。Czitrom AA等[5]用Moloney肉瘤病毒对F344，Wistar-Lewis和ACI杂和系三种品系的大鼠进行诱导，肿瘤发生率为93％，从开始诱导到出现明显症状的平均时间为10天，且所有模型均发生了肺转移。病毒诱导模型较物理化学诱导费时要短，动物模型可重复性高，所进行的研究也更系统更准确。
1.2 移植型肿瘤模型
可移植肿瘤是指能够在同系、同种或异种动物体内传代生长的肿瘤。将肿瘤组织块或细胞株移植到动物体内某个部位，形成与原发瘤相同的肿瘤，再移植到下一代，从而建立动物模型。肿瘤移植分为同种移植和异种移植，异种移植目前多应用于免疫缺陷动物。移植型肿瘤模型是目前国内外肿瘤实验研究中常用的动物模型，制作简便；肿瘤生长一致，对宿主影响类似；可控性强，耗时短，肿瘤接种成活率高。
同种移植：指用诱导得到的骨肉瘤在分离出肿瘤细胞后，移植到同种异体或同系动物体内。同种移植受免疫系统的影响，新生动物或免疫缺陷动物移植成功率高，成年动物移植成功率相对要低。Czitrom AA等[5]将Moloney骨肉瘤病毒注射到大鼠胫骨髓腔内，诱导产生骨肉瘤，再将得到的肿瘤细胞以不同剂量和不同方式接种到成年大鼠体内，建立了大鼠骨肉瘤动物模型及肺转移模型。研究发现移植所致肿瘤与原发肿瘤形态上较一致，且移植受组织相容性影响：在组织相容性抗原相同的品系之间，无论采取多少剂量和何种注射途径，肿瘤均可生长，而在组织相容性抗原不同的品系之间移植，肿瘤不生长。于哲等[6]用UMR-106骨肉瘤细胞株接种SPF级大鼠，研究发现细胞接种数量和肿瘤形成及肺转移发生密切相关，接种105数量级的大鼠，肿瘤及肺转移均未发生；接种106级大鼠仅有个别个体有肿瘤形成，但进展缓慢，且未发生肺转移；接种107组大鼠肿瘤发生率达到100％，且形体较大，进展迅猛，镜下可见肿瘤内血管丰富，肺转移率达到70％。
异种移植：由于动物免疫系统的影响，早期的异种移植动物模型成功率低。后来由于免疫抑制剂的使用，特别是免疫缺陷动物的应用，才使得异种移植得以成功实现。Crnalic S等[7]将组织形态完整的人类骨肉瘤组织，用显微外科技术移植到31只裸小鼠的胫骨近端，所有小鼠在移植局部发生了骨肉瘤，且与人类骨肉瘤在影像学和组织学表现上均相似；所有的小鼠肿瘤均发生了肺转移；这些均与人类骨肉瘤相类似，是一个很好的动物模型。Kimura等[8]将HuO9及其亚型HuO9-M132和HuO9-M112人类骨肉瘤细胞株通过尾静脉注射到BALB/c雌性裸小鼠体内，成功地建立了伴有肺转移的骨肉瘤动物模型。师长宏等[9]用人成骨肉瘤细胞系LJH-OS的传代移植瘤组织作为移植材料，对BALB／c-nu/nu裸鼠进行胫骨原位移植及皮下移植，原位移植的成功率为80％，肿瘤发生了肺转移。裸鼠原位移植模型的恶性生物学行为接近临床骨肉瘤患者的实际情况，原位移植模型的建立为骨肉瘤的研究提供了良好的实验模型。
常用移植细胞株：移植细胞株按其来源可分为鼠源性和人源性。鼠源性细胞株的优点是肿瘤可以生长在一个与其来源相同的微环境中，可以更好地研究肿瘤与宿主间的相互关系。人源性细胞株可以用来研究基因突变是如何导致肿瘤发生和转移的，从而为临床治疗提供帮助。常用的鼠源性细胞株包括K7M2和K12；UMR106-01;Dunn和LM8等。K7M2为高转移性，K12为低转移性细胞株，两者可比较用于研究肿瘤转移的不同机制和新型治疗方案的可行性。UMR106-01常用于研究成骨细胞的功能以及不同激素,不同生长因子对成骨细胞的作用；Dunn和LM8常用于研究抗癌药物的有效性和肿瘤转移的器官选择性[10,11]。常用的人源性细胞株包括POS-1；HuO9及其亚型HuO9-M132和HuO9-M112；TE-85及其亚型MNNG/HOS和143B；U2-OS；SAOS-2等。其中POS-1，HuO9及其亚型和143B等建立的动物模型肿瘤可以自行发生肺部转移，与人类肿瘤表现类似，是较好的研究模型[8,12,13]。
2 动物模型的应用
2.1 发病原因的研究
骨肉瘤发病原因不明，死亡率高。利用动物模型来进行肿瘤发病原因的研究，是动物模型的主要作用之一。犬类可自发骨肉瘤，在发病原因、临床表现、病影像学特征、转移率和转移部位以及对治疗的反应等方面均与人类类似[14]，是研究骨肉瘤发病原因的理想模型。p53基因突变丧失抑癌功能常是人类恶性肿瘤，包括骨肉瘤的发病原因。Leeuwena IS等[15]以自发骨肉瘤的犬为研究模型，分析p53基因突变与骨肉瘤发病的相互关系，发现携瘤犬均发生p53基因突变，且突变频率与人类相类似。Johnson AS等[16]用单链构象多态性方法研究p53在人类与犬类骨肉瘤发生中所起的作用，发现p53基因突变的位点和类型在两者几乎完全相同。
2.2 转移机制的研究
肿瘤转移是骨肉瘤致死的主要原因。骨肉瘤常转移至肺部，发生肺转移后5年生存率不到30％。因此，对肿瘤转移机制的研究具有极其重要的意义。Ory B等[12]用POS-1骨肉瘤细胞株移植到C3H/He裸鼠体内，建立可以自发肿瘤肺转移的动物模型来研究zoledronic acid抑制骨肉瘤肺转移的情况。研究发现zoledronic acid能够抑制骨肉瘤肺转移，且肿瘤抑制程度与药物剂量有一定关系。使用zoledronic acid抑制的裸鼠，注射骨肉瘤细胞株后21天肉眼观察不到肿瘤肺转移，45天组织学检查不能发现转移病灶。Akira K等[13]以雄性C3H/Hej小鼠移植POS-1骨肉瘤细胞株来研究缺血再灌注对骨肉瘤生长及肺转移的影响，发现将小鼠肢体捆扎一段时间后再放松可以明显降低骨肉瘤肺转移，认为缺血再灌注可以产生活性氧对肿瘤产生抑制作用，活性氧可以抑制肿瘤的局部生长和肺部转移。肿瘤伴发抵抗是指某些原发肿瘤可以产生一些抑制血管生成的蛋白因子，通过与系统蛋白的作用，抑制肿瘤的远处转移，使肿瘤处于“休眠”状态。Pirie-Shepherd S.R.等[17]以自发骨肉瘤的Pet犬为研究模型，研究肿瘤伴发抵抗现象。他们从荷瘤动物的尿中发现了“血管抑素”的片段，“血管抑素”是一种强有力的抑制血管生成的蛋白因子，并发现当肿瘤切除后，从同一动物的尿中未发现该物质，术后2.5~14个月内所有实验犬均死于肿瘤肺转移。该模型为分离内源性血管生成抑制因子和应用血管抑制肿瘤提供了实验基础。
2.3 治疗效果的评价
在利用肿瘤动物模型进行治疗的研究中，最早用于测试化疗药物的效果。Tomoda R等[18]以Fischer 344 大鼠移植S-SLM鼠骨肉瘤细胞株来研究小剂量甲氨蝶呤对骨肉瘤肺转移的治疗作用，发现小剂量甲氨蝶呤可以明显地减少肿瘤肺转移结节的数量，用组织免疫化学染色发现肺部转移结节内微血管密度也大大减少，肺湿重也明显减轻。
免疫疗法是肿瘤治疗的新途径。Onda M等[19]用荷人骨肉瘤的严重联合免疫缺陷小鼠来研究TP-3免疫毒素的抗肿瘤效果，发现TP-3免疫毒素可抑制肿瘤生长。当免疫毒素注入小鼠体内后，肿瘤体积明显减小，且双价TP-3免疫毒素的抗肿瘤效果是单价毒素的2倍。Merchant MS等[20]用BALB/c、SCID和SCID-bg裸小鼠研究免疫重建对骨肉瘤肺转移的影响，发现将T细胞转入免疫缺陷型裸鼠体内后，肿瘤肺转移的复发率大大降低。Duan X等[21]用SPF级裸小鼠接种人类LM7骨肉瘤细胞株，研究发现联合应用IL-12基因治疗和异环磷酰胺化疗可通过Fas/FasL 途径促使肿瘤细胞凋亡，抑制骨肉瘤肺转移。
3 存在问题及展望
理想的动物模型能够展现人类骨肉瘤的全部特性，特别是肿瘤的生物学、基因学、发病学以及治疗学等方面的特性。但目前，肿瘤模型与人类肿瘤在生物学特性、放射学、组织学等方面尚存在一定差别。犬类可自发骨肉瘤，但多见于成年犬，发病相对晚，病情非常迅速，与人类有一定差别[22]。病毒诱导的动物模型与人类相比，在生物学特性上有所不同，其潜伏期极短，病灶多发性且肿瘤致死率更高[5]。Sead C等[7]发现：在荷人类骨肉瘤的裸鼠，肿瘤细胞与人类存在差别，其梭形基质细胞和小深染基质细胞较多，而人类该类细胞相对较少。
随着基因工程技术的发展，越来越多的转基因动物模型用于肿瘤的研究。这类模型可以很好地模拟人体内生理、病理环境，与所研究肿瘤的发生过程具有较好的一致性，而且可模拟部分癌前病变。基因人工敲除和敲入在动物体内的研究有利于揭示肿瘤的分子机制，为人类骨肉瘤研究提供全新的途径。必将有更符合人类骨肉瘤特点的新型动物模型得到应用，为最终攻克骨肉瘤打下坚实的基础。
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