高浓度葡萄糖对培养的人视网膜色素上皮细胞细胞表面黏附分子-1的影响
作者：韩小霞，惠延年，宋虎平，王海涛，张晓光，刘百军
【摘要】 研究高浓度葡萄糖对体外培养人视网膜色素上皮（RPE）细胞细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法：用免疫荧光法检测5.6mmol/L和30.0mmol/L葡萄糖作用1，2，3d后 hRPE细胞表面ICAM-1表达量，MTT方法检测两种浓度葡萄糖作用下48h hRPE表面黏附白细胞的数量。结果：30.0 mmol/L葡萄糖作用1，2，3d后 hRPE细胞表面荧光着色密度分别为5.6mmol/L葡萄糖作用下荧光着色的2.4，3.8，4.0倍。30.0mmol/L葡萄糖作用48h后hRPE细胞表面黏附的白细胞数量是5.6mmol/L葡萄糖组的2.34倍，有统计学显著性差异（P ＜0.05）。结论：高糖可以促进体外培养hRPE细胞的ICAM-1表达，提示RPE细胞在高糖作用下可能参与了糖尿病视网膜病变的早期病理反应。
【关键词】 人视网膜色素上皮细胞
0引言
近年的研究表明，糖尿病发病机制中有低度慢性炎症反应参与，白细胞通过细胞间黏附分子（ICAM-1）引起在视网膜附着和活化，造成视网膜微血管渗出等炎症改变。其中高浓度葡萄糖的直接作用也得到研究者的证实[1]。高糖可以抑制微血管内皮细胞的增生[2]，降低细胞连接蛋白的表达量，从而使细胞的形状发生改变，使大分子物质突破内皮细胞屏障[3]。视网膜色素上皮细胞作为视网膜的外屏障，转运大量葡萄糖为视网膜神经感觉层提供能量[4]，更受到血糖波动的影响，发生病理和功能的改变。但是在体外研究中有关RPE细胞在高血糖的作用下的改变还少有报道，我们研究高浓度葡萄糖对体外培养的人视网膜色素上皮ICAM-1表达的影响，探讨RPE细胞是否参与早期DR病变的病理变化过程。
1材料和方法
1.1材料 我们以角膜移植供体眼做原代培养人RPE（hRPE）细胞，建立有限hRPE细胞系, 采用第3～6代细胞作为实验细胞[5]， 抗人角蛋白抗体和KG8.13抗体免疫组织化学染色鉴定细胞。细胞培养采用正常浓度葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）干粉（Gibco公司，葡萄糖浓度：5.6mmol/L）；每袋正常葡萄糖浓度DMEM培养基干粉添加24.4mmol D-葡萄糖（Sigma公司），配制成含高浓度葡萄糖的DMEM培养液（葡萄糖浓度：30.0mmol/L）。
1.2方法
1.2.1 MTT比色法 绘制正常浓度葡萄糖培养液及高浓度葡萄糖培养液培养的hRPE细胞生长曲线。取近铺满的RPE细胞用2.5g/L胰酶消化后，以含100mL/L新生牛血清（四季青公司）正常浓度葡萄糖 DMEM细胞培养液重悬，5×106/L的密度接种于96孔板，待24h细胞贴壁伸展后，换用含不同浓度葡萄糖（Ⅰ组5. 6mmol/L，Ⅱ组30.0mmol/L）DMEM细胞培养液在37℃、5mL/L CO2孵箱中培养， 每2d更换培养液，每组设有3个副孔。每24h随机选择一块96孔板，每孔加入5g/L的MTT（Sigma公司）溶液200μL，孵箱孵育4h，吸出上清，加入二甲基亚砜（DMSO）20μL，在摇床上震荡10min，设空白对照孔，于酶标仪上用490nm波长读取吸光度，根据每组吸光度平均数值描绘细胞生长曲线[6]。
1.2.2免疫荧光法检测hRPE细胞ICAM-1的表达 RPE细胞消化后，以5×106/L的密度接种40μL细胞悬液于预先放置在24孔培养板中的8mm×8mm盖玻片上，4h后加含100mL/L灭活小牛血清的DMEM正常浓度葡萄糖培养液1mL，在37℃、50mL/L CO2孵箱中培养24h后，按不同组分别添加含5.6mmol/L，30.0mmol/L 葡萄糖的DMEM培养液，每组包括6个培养孔，每2d更换培养液。每天分别取出不同组细胞爬片，0.01mol/L PBS洗2次，950mL/L酒精-20℃固定20min，空气干燥，-20℃保存。固定的细胞爬片恢复至室温，经0.01mol/L PBS反复冲洗，滴加5mL/L H2O2 /甲醇室温孵育30min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗后0.01mol/L PBS震洗，滴加1∶50正常羊血清，室温放置30min，倾去，滴加鼠抗人ICAM-1 mAb( Santa Cruz公司，1∶50)，湿盒内4℃过夜，PBS漂洗3min，3次，滴加荧光素标记羊抗鼠IgG ( Santa Cruz公司，1∶50) ，37℃放置30min后，PBS漂洗3次，每次5min。缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察、照相。同时设PBS替代第一抗体的空白对照和正常羊血清（中山公司，1∶50) 替代第一抗体的替代对照。
1.2.3 RPE细胞表面白细胞黏附率实验 RPE细胞准备同前，调整细胞密度至1×108/L，200μL /孔接种于96孔培养板，24h后按分组（Ⅰ、高糖组 Ⅱ、正常葡萄糖组 Ⅲ、蔗糖组）更换30.0mol/L葡萄糖、5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液及5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L蔗糖培养液，培养48h。设置空白对照孔和RPE细胞对照孔。取健康成年人外周静脉血，肝素抗凝，加等量30g/L明胶，37℃静止沉淀1h，取上层液加入D-Hanks液2 000r/min离心，去上清，重复洗两次，Hanks液重悬，调整细胞浓度至1×109/L。按2×105/孔加白细胞悬液至96孔板，37℃孵育30min，摇床上轻摇1min，吸除未贴壁细胞，重复1次，行MTT比色实验：贴壁细胞的吸光度值（△A）＝各组细胞的吸光度值（A）-RPE细胞基础吸光度（A０），所得数值经统计学分析，做组间比较[7]。
统计学处理：采用SPSS10.0 统计软件,数据以x±s表示，采用t检验进行统计学分析。P＜0.05有统计学意义。以上实验均重复3次。
2结果
刚接种的原代RPE细胞含有较多的黑色素，看不到细胞核。RPE伸展成椭圆形、多边形后，可见透明的细胞核。培养中黑色素粒逐渐脱失，至3代，黑色素粒基本不见（图1）。
2.1 MTT比色实验结果 高糖组hRPE细胞生长曲线较正常浓度葡萄糖组细胞生长曲线为低，但统计学分析组间无明显差异（P＞0.1，图2）。
图2 5.6mmol/L、30.0mmol/L葡萄糖作用下hRPE细胞生长曲线
2.2免疫荧光染色 在蓝绿激光激发下，正常浓度葡萄糖培养液组的细胞膜和胞质着较浅的绿色荧光，高糖培养液组的细胞质及胞膜均有明显的荧光着色，细胞核不着荧光。空白对照和替代对照组的细胞无荧光着色。应用Image pro-plus 5.0软件做图像分析处理: 正常浓度葡萄糖组细胞微量表达荧光（0.6146±0.0989），且3d间荧光变化无统计学意义（P＞0.1）。高糖组细胞荧光染色强，而且随时间延长而增强：1，2，3d荧光密度分别是第1d正常葡萄糖组的2.4，3.8，4.0倍（图3，4）。高糖组荧光染色强度高于正常浓度葡萄糖组，且组间差别有统计学意义（P＜0.05＝。
图3 hRPE细胞抗ICAM-1荧光着色
A:正常浓度葡萄糖组；B:高糖组
图4 不同浓度葡萄糖培养液2d hRPE细胞荧光着色×200
2.3 RPE细胞表面黏附WBC细胞数量 高糖组hRPE细胞上黏附的外周血白细胞吸光度（0.07867±0.00568）高于正常浓度葡萄糖组(0.03367±0.00568)1.34倍（P＜0.01），而作为渗透压对照的5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L蔗糖组，白细胞的吸光度（0.04005±0.00784）与正常浓度葡萄糖组没有显著性差异（P＞0.2）。
3讨论
作为糖尿病的并发症之一， 糖尿病性视网膜病变是临床上糖尿病相关盲的首要病变，严重威胁糖尿病患者的视力[8]。虽然目前糖尿病的病因和发病机制仍未完全阐明，但近年来炎症学说日益受到关注。该学说以大量的临床资料和临床研究指出：糖尿病是一种免疫和低度炎症性疾病，糖尿病性视网膜病变被认为是源于视网膜血管内皮受损引起视网膜内屏障破坏而引发的病理改变。细胞间黏附分子-1（ICAM-1）在炎症的发生过程中发挥着重要的作用，成为糖尿病研究的热点。 ICAM-1是一种跨膜单链糖蛋白，分布广泛，作为配体与白细胞表面LFA-1结合，而使白细胞在多种内皮细胞和上皮细胞上黏附而参与炎症反应[9]。正常情况下细胞较少表达或不表达ICAM-1，而在糖尿病患者[10]和糖尿病大鼠模型[11]，视网膜ICAM-1表达上升。
体外研究显示，高血糖具有细胞毒性，Mayumi等[2]观察到高糖使细胞增长受到抑制，庞燕等[12]、王大江等[13]、罗静等[14]分别观察到高糖可以促进血管内皮细胞和周细胞凋亡，而Lee等[3]进一步证实高糖作用下小鼠心脏内皮细胞间连接蛋白减少，使细胞形状发生改变，可造成大分子物质的渗漏。RPE细胞排列成单层，以其间的紧密连接成为血—视网膜外屏障，是参与增殖性视网膜病变的重要细胞[15]。炎症因子等可以促进RPE合成血管内皮生长因子（VEGF），后者在视网膜新生血管生成过程中起关键作用。RPE运送大量的葡萄糖由脉络膜毛细血管进入视网膜，满足视网膜外层视细胞的高代谢活动，因此RPE细胞较容易受到血糖浓度的影响[16]。Grimes等[17]观察到早期糖尿病大鼠的RPE细胞基底膜面褶皱增多，高糖刺激还可以使RPE细胞表达的葡萄糖转运蛋白发生变化，通过蛋白激酶C上调RPE细胞表达VEGF[18]。实验中，我们单纯应用高浓度的葡萄糖作为刺激因素，发现高糖刺激可以使hRPE细胞表面ICAM-1表达增强，而且，在高糖环境，RPE细胞表面黏附的白细胞数量增加。另外5.6mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L蔗糖培养液并没有引起RPE细胞表面黏附的白细胞数量增加，说明高渗透压本身不能增加白细胞在RPE细胞表面的黏附，即高渗透压本身不能促进RPE细胞产生ICAM-1。我们观察到在高糖作用下hRPE生长曲线低于正常葡萄糖浓度条件下的细胞生长曲线，但是并没有得到统计学的支持，因此我们认为，在糖尿病初期， RPE细胞可能已经通过表达细胞间黏附分子，使白细胞在其表面黏附、活化，进而释放炎性介质，而后者又激活RPE细胞，通过释放VEGF等因子引起视网膜血管内皮细胞增生，参与和促进了增殖性糖尿病视网膜病变的进程。另外我们考虑由于RPE细胞的转运葡萄糖作用，使其承受高糖的能力较其他细胞强，单纯30.0mmol/L的高糖还不足以对RPE细胞的增生造成影响，所以在早期糖尿病性视网膜病变中不能检测到病理性的RPE细胞。因此我们推测，视网膜色素上皮细胞在高血糖的作用下，与视网膜内皮细胞一起，共同参与了糖尿病性视网膜病变的早期病理变化。这为我们进一步的了解糖尿病性视网膜病变的病因病程提供了另一种思路和可能。然而，体内的生理环境与体外的培养条件不完全等同，在体内，高血糖是否可以直接作用于hRPE细胞并引起与体外相一致的病理变化还有待于在动物模型上进一步研究证实。
【】
1 Daibetes Control and Complications Trial (DCCT) Research Group. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long 2 term complications in insulin dependent diabetes. N Engl J Med ,1993;329:977-986
2 Abe M, Ono J, Sato Y, Okeda T, Takaki R. Effects of glucose and insulin on cultured human microvascular endothelial cells. Diabetes Res Clin Pract ,1990;9(3):287-295
3 Lee HZ, Yeh FT, Wu CH. The effect of elevated extracellular glucose on adherens junction proteins in cultured rat heart endothelial cells. Life Sci ,2004;74(17):2085-2096
4 Udono T , Takahashi K, Nakayama M. Induction of adrenomedullin by hypoxia in cultured retinal pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci ,2001;42:1080-1086
5王雨生,严密,杨抚华.视网膜色素上皮细胞培养技术及其应用.中华眼底病杂志,1994;10:124
6司徒镇强,吴军正,主编.细胞培养.西安:世界图书出版公司,2003:250-252
7吴雄文,梁智辉,主编.实用免疫学实验技术.武汉:湖北技术出版社;2002:122-124
8赵琴,柳林,温新富,刘志勇,徐琪.II型糖尿病患者视网膜病变与糖化血红蛋白及糖化血清蛋白的关系.国际眼科杂志,2004;4(2):285-287
9 Jan CD, Shimaoka M, Carman CV. Dimefization and the effectiveness of ICAM-1 in mediating LFA-1-dependent adhesion.Proc Natl Acad Sci USA ,2001;98:6830-6835
10 Mcleod DS, Lefer DJ, Merges C. Enhanced expression of adhesion molecules-1 and P-selectin in the diabetic human and choroids. Am J Pathol ,1995;147(3):642
11 Nozaki M, Ogura Y, Hirabayashi Y. Enhanced expression of adhesion molecules of the retinal vsscular endothelium in spontaneous diabetic rats. Ophthalmic Res ,2002;34(3):642
12庞燕,罗清礼.高糖条件下血管内皮细胞的增殖与凋亡.华西医学,2005;4(6):30-32
13王大江,方伯言,刘学政,黄一飞.维生素B1对高糖所致牛视网膜微血管内皮细胞损伤的保护作用.国际眼科杂志,2005;5(1):77-79
14罗静,姜德咏,陈忠平,李雯玲.高糖诱导培养的牛视网膜血管周细胞凋亡.眼科新近展,2005;3(2):42-44
15惠延年.增殖性玻璃体视网膜病变.实用眼科杂志,1990;11:001
16姚毅,关明,赵秀琴,黄一飞.缺氧和高浓度葡萄糖对体外培养人视网膜色素上皮衍生因子表达的影响.中华医学杂志,2003;83(22):1989-1992
17 Grimes PA, Laties AM. Early morphological alteration of the pigment epithelium in streptozotocin-induced diabetes: Increased surface area of the basal cell membrane. Exp Eye Res ,1980;30(6):631-639
18 Young TA, Wang H, Munk S, Hammoudi DS, Young DS, Mandelcorn, Whiteside CI. Vascular endothelial growth factor expression and secretionby retinal pigment epithelial cells in high glucoseand hypoxia is protein kinase C-dependent. Exp Eye Res ,2005;80:651-662
