NQO1基因多态性与食管癌易感性的病例对照研究
作者：周艳丽，陈华芳，史习舜，周紫荆，李国梁，潘培川，陈子龙，吴清波
【摘要】 ［目的］ 研究NQO1基因多态性与食管癌易感性的关系。［方法］ 采用1：2配对的病例对照研究，运用PCR,RFLP技术检测NQO1基因C609T多态性。［结果］ NQO1 609 CC、CT和TT各基因型在病例组中的频度分别为27.1％、43.7％和29.2%，在对照组分别为32.8％、50.0％和17.2％，两组间的分布差异有统计学意义。携带NQO1 609TT基因型的个体患食管癌的风险高于携带609CC或609CT基因型者（OR=2.019，95％CI=1.112～3.663）。吃葱蒜与NQO1基因型TT之间存在次相乘模型的交互作用(OR=9.849，95％CI=3.733～25.985)；饮烫茶与NQO1 TT危险基因型之间存在次相乘模型的交互作用(OR=4.847，95％CI=1.817～12.929)。［结论］ NQO1609TT基因型是食管癌的危险因素之一；609TT基因型食管癌发生风险的作用有明显的放大效应。
【关键词】 食管肿瘤 病例对照研究 NQO1基因多态性 交互作用
A Case,control Study on the Polymorphisms of NQO1 and Susceptibility of Esophageal Cancer
Abstract: ［Purpose］ To investigate the relationship between genetic polymorphism of NQO1 and susceptibility to esophageal cancer. ［Methods］ This investigation was conducted by 1∶2 matched case,control study, and the C609T polymorphism in gene NQO1 was determined with PCR,RFLP technique. ［Results］ The frequencies of NQO1 609CC,CT and TT genotype in esophageal cancer group were 27.1%, 43.7% and 29.2% respectively, while 32.8%,50.0% and 17.2% in control group, respectively. The distribution was statistically significant difference between both groups. Individuals carrying NQO1 609TT genotype had a significant increased risk for esophageal cancer (adjusted OR=2.019, 95%CI:1.112～3.663) compared to those with 609CC or 609CT genotype. There were the interaction of submultiplicity model between allium vegetables consumption and NQO1 TT genotype (OR=9.849, 95％CI: 3.733～25.985) , and between over,hot tea drinking and NQO1 gene (OR=4.847, 95％CI:1.817～12.929). ［Conclusions］ NQO1 609TT genotype is one of the risks for esophageal cancer. The NQO1 609TT genotype has significant amplification effect on the risk of esophageal cancer.
Key words: esophageal neoplasms; case,control study; NQO1 gene polymorphisms; interaction 代谢酶基因多态性是不同个体代谢酶活性差异的主要原因，从而影响个体患癌的易感性。依赖还原型辅酶Ⅰ/Ⅱ：醌氧化还原酶(NQO1)又称D,硫辛酰胺脱氢酶，催化醌类及其衍生物发生还原反应转化为氢醌，为人体内一种重要的Ⅱ相反应酶。而醌是一类在界中广泛存在的有毒化合物，能诱发哺乳动物细胞癌变和坏死。研究发现NQO1存在多态性，即C609T，这个变异使酶活性显著降低。我们以福建省食管癌高发区安溪县为研究现场，在进行环境因素调查研究的同时，对NQO1基因多态性与食管癌的关系进行了探讨，并结合安溪高发区的环境危险因素对基因与环境的交互作用进行了初步分析。
1 材料与方法
1.1 研究对象
病例组为2003年11月至2004年8月间，经安溪县内窥镜及病理诊断确诊为食管癌的新发病例，剔除年龄＞75岁及体质虚弱者。对照组按1∶2配对，选择与病例居住同一乡村、无血缘关系、同民族、同性别、年龄相差±3岁以内的同期同院的非肿瘤患者（如心脑血管疾病、外伤等患者）为对照。病例和对照均为安溪县居民，并为当地常住户口(20年以上)。
1.2 调查方法及内容
采用统一编制的调查表，由经过培训考核合格的调查员直接询问每名研究对象后填写。调查内容主要有：一般情况、日常生活行为习惯（如吸烟、饮酒、饮茶等）、饮食习惯、饮食结构、居住史、家庭消费情况，消化系统疾病史及食管癌家族史等。
1.3 NQO1基因多态性的检测
运用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（PCR,RFLP）技术检测研究对象的NQO1C609T基因型。
1.3.1 标本收集及DNA提取
抽取各研究对象外周血5ml，置于一次性生化采血管中，离心分层，分装上层血清和下层血凝块，置于低温冰箱（－70℃）保存。采用常规高盐沉淀法提取基因组DNA[1]。
1.3.2 PCR扩增[2]
(1)引物序列为：Primer F：5′,AAGCCCAGACCAACTTCT,3′，PrimerR：5′,GCGTTTCTTCCATCCTTC,3′，由上海博亚生物技术有限公司合成。(2) PCR扩增反应体系：反应总体积为25μl，其中含10×PCR buffer 2.5μl，1.5 mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs，引物F、R各0.2μmol/L，Taq DNA聚合酶（MBI产品）1.5U，基因组DNA80ng~100ng。(3) PCR循环参数：95℃预变性5min，然后94℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸45s，35个循环后，72℃延伸10min。
1.3.3 HinfⅠ酶切反应
酶切体系为20μl，包括：10×buffer 2μl，HinfⅠ内切酶（NEB产品）0.5μl（5U），超纯水7.5μl，PCR扩增产物10μl。酶切反应条件为：37℃水浴6h。酶切产物用2％琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）、电压90V电泳1h。
NQO1基因型的判断：酶切片段仅195bp者为纯合野生基因型CC；195bp、119bp和76bp者为杂合基因型CT；119bp和76bp者为纯合突变基因型TT（见图1）。
1.4 统计分析方法
全部数据采用SPSS12.0软件建立数据库。运用χ2检验比较NQO1基因频率的Hardy,Weinberg遗传平衡检验，NQO1 C609T基因在病例组和对照组分布的特点和差异。运用叉生分析的原理观察NQO1 C609T基因型、环境因素、遗传因素之间的交互作用。参照[3]的方法评价交互作用：多因素Logistic回归模型中包括单独遗传因素、单独环境因素和两因素共同组成变量的效应，βg、βe和βeg分别为三者的回归系数，也即ORg、ORe和OReg的自然对数。交互作用系数γ＝βeg/βe，γ＞1，表示遗传因素对环境暴露效应有放大作用；γ＜1，表示遗传因素对环境暴露效应有减弱作用；γ＝1，则两者没有交互作用。当OReg＝ORe×ORg为交互作用的相乘模型；OReg＞ORe×ORg为交互作用的的超相乘模型；OReg＜ORe×ORg为交互作用的次相乘模型；OReg＝ORe＋ORg-1时，则为相加模型。
2 结 果
2.1 病例组和对照组一般特征的描述
本次研究按1∶2配对，共有96对完成了问卷调查和实验室检测，其中男性58对（60.42％），女性38对（39.58％），性别比为1.53∶1。食管癌病例组和对照组在性别、年龄、状况及文化程度等方面的分布差异无统计学意义，但职业分布差异有统计学意义，与对照组相比，食管癌患者以农民为主，文盲所占比重较高（见表1）。
2.2 NQO1基因型频率及遗传平衡检验
对病例组和对照组NQO1 C609T基因型频率进行了Hardy,Weinberg遗传平衡检验，两组的基因型频率观察值与期望值之间差异无统计学意义（χ2值分别为1.49和0.12，P值均＞0.05），表明病例组和对照组的NQO1基因型频率均符合Hardy,Weinberg遗传平衡定律，样本具有群体代表性。
食管癌病例组和对照组NQO1基因型分布及等位基因频率见表2、3、4。NQO1 609 CC、CT和TT各基因型在病例组中的分布分别为27.1％、43.7％和29.2%，在对照组中的分布分别为32.8％、50.0％和17.2％，表明NQO1各基因型在病例组和对照组的分布差异有统计学意义（χ2＝3.966，P＝0.046）。与609CC和609CT基因型相比，609TT基因型与食管癌的发生有显著性关联，在年龄、性别和住址等因素调整后OR＝2.019，95％CI=1.112～3.663。病例组与对照组609T等位基因频率分别为51.0％和42.0％，两组间的差异有统计学意义（χ2=4.052，P=0.044）。
2.3 NQO1基因多态性与各危险因素的交互作用的分析
分别分析NQO1 609CC、CT、TT基因型及危险基因型TT与食管癌发生相关危险因素的交互作用。经年龄、性别、居住地、经济状况及文化程度等因素调整后，仅发现TT基因型与不吃葱蒜之间存在交互作用（见表5）。未发现NQO1基因多态性与饮酒、高盐饮食、食用红薯干、食管癌家族史及食用新鲜蔬菜之间存在交互作用。
与食用葱蒜史之间交互作用分析结果显示，在TT基因型存在时，不吃葱蒜者患食管癌的风险增大， OR值为9.849，而吃葱蒜者OR值降至2.739，TT基因型与不吃葱蒜存在次相乘模型的交互作用（表5）。
2.4 饮乌龙茶与食管癌的关系
本次研究发现饮烫茶的人群（OR＝5.749）较饮温茶或凉茶的人群（OR＝0.252）更易患食管癌，而且茶叶质量越好患食管癌的风险越低（OR＝0.210,95%CI:0.084～0.529）。交互作用分析中发现喝烫茶与NQO1基因多态性及食管癌家族史之间存在显著的交互作用，结果见表6、7。
表6显示，单独暴露于饮烫茶的估计相对危险性ORe为3.478，当同时携带NQO1 TT危险基因型时，其OReg值升至4.847，增加了暴露于饮烫茶的危险效应，两者的交互作用符合次相乘模型。而食管癌家族史与饮烫茶之间的交互作用为超相乘效应，同时暴露于食管癌家族史和饮烫茶者发生食管癌的风险（OR＝8.396）明显高于单独暴露于食管癌家族史者（OR＝1.874）或饮烫茶者（OR＝2.584）（见表7）。
3 讨 论
NQO1，即NAD(P)H：醌氧化还原酶，是体内一种重要的Ⅱ相反应酶。NQO1以NAD(P)H为受体，可将NADH或NADPH的传递给醌类及其衍生物，发生双电子还原反应，生成低毒的氢醌类化合物，其催化特性在于无单电子还原产物半醌及自由基等氧化产物形成，避免了对细胞的损伤，降低具有致癌性和致畸性的醌类化合物的危害[4]。NQO1与其他Ⅰ、Ⅱ相代谢酶一起构成了体内对外源致癌物质的代谢，在机体的解毒代谢中发挥着重要作用。
在正常人群中,该酶的活性存在差异。20世纪90年代初期，有研究发现NQO1基因cDNA609位点上存在C/T间单核苷酸多态性，可能改变了酶的二级结构，使酶的活性降低，增加了氧自由基的生成[5，6]。纯合野生基因型CC具有完全的NQO1酶活性, 杂合基因型CT的酶活性较纯合野生型降低3倍，纯合突变基因型TT的酶活性则完全丧失[7，8]。因此，NQO1缺陷可降低细胞解毒致癌物的能力，从而影响细胞代谢途径，增加致癌物负荷并能导致某些易感个体恶性变。由于NQO1在醌类化合物的解毒过程中起着很重要的作用，所以它的基因多态性日益受到人们的重视。经研究发现NQO1多态性与大肠癌[9]、肺癌[10]、白血病[11，12]等有显著相关性。
目前关于NQO1多态性与食管癌关系的研究并不多，我们采用匹配的病例对照研究，以福建省食管癌高发区之一安溪县为现场，分析了NQO1基因多态性与当地食管癌易感性的关系，研究发现NQO1基因多态性与食管癌的遗传易感性有关。因为携带纯合突变基因型TT 者完全丧失NQO1酶活性，故我们进一步分析比较了病例组和对照组TT基因型的分布差异，结果表明，携带纯合突变基因型TT 的个体发生食管癌的危险性比携带野生型基因型CC和杂合突变基因型CT的个体高1.019倍（95％CI=1.112～3.663），提示具有纯合突变基因型TT的个体可能是当地发生食管癌的高危人群。Zhang J等[13]研究显示NOQ1 C609T基因型分布在高加索人和人群中具有显著差异（χ2＝68.40，P<0.001），携带TT基因型者比携带CC、CT基因型的个体发生食管癌的危险性分别增高3.62倍和0.81倍，与本次研究结果相似。
交互作用分析结果表明：不吃葱蒜与NQO1TT基因型之间的交互作用符合次相乘模型，这与葱蒜其中所含化合物对机体氧化还原代谢酶系的诱导作用有关。本次研究未发现食管癌家族史与NQO1基因之间存在交互作用，但是在同时暴露于食管癌家族史和TT危险基因型发生食管癌的风险会高于单独暴露于这两个危险因素者。而Zhang J等研究发现，在中国人群中，暴露于上消化道肿瘤家族史者会增加发生食管癌的风险（OR＝2.18，95% CI=1.14～4.17）[13]，提示携带NQO1纯合突变基因型造成的NQO1酶活性的缺乏可能为家族中上消化道肿瘤聚集的遗传机制之一。这些结果均进一步说明了食管癌的发生是环境因素和遗传因素相互作用的结果。
目前已有大量的研究资料表明饮茶对食管癌具有保护作用，这主要与茶叶中含有的茶多酚、茶色素、L,茶氨酸有关，这些物质具有抗氧化作用，可以清除体内的氧自由基，抑制生物大分子DNA、蛋白质等的氧化损伤[14]。实验结果发现无论是绿茶还是红茶都可在甲基苄基亚硝胺(NMBzA)和甲基烷基亚硝胺(MANA)的动物模型中减少鼠的肿瘤发生[15]。本次研究发现饮用质量好的乌龙茶是食管癌的保护因素，而饮烫茶是食管癌的危险因素，这可能与安溪县是乌龙茶的主要产地，当地居民饮茶现象比较普遍，但是不同水平的人群饮用茶叶的质量不同，而茶叶质量越好，其含有的有效成分较一般茶叶多，而含有较少的有害物质，从而降低食管癌的发病风险。饮烫茶在当地是居民饮茶的一个普遍习惯，已有实验证实70℃以上烫食对食管黏膜上皮细胞的增殖周期会产生严重影响，并且为细胞在有害代谢产物作用下产生癌变创造了有利条件[16]。这也是国内外大量流行病学研究结果一致证实了热刺激是食管癌发病因素之一的依据。因此不良的饮茶习惯可以降低饮茶的保护作用，这是致癌或抗癌因素的混杂与交互作用的结果。
饮茶习惯与基因、遗传因素的交互作用分析显示：饮烫茶与NQO1 TT危险基因型之间存在次相乘效应的交互作用，而食管癌家族史与饮烫茶之间的交互作用为超相乘效应，同时暴露于食管癌家族史和饮烫茶者发生食管癌的风险（OR＝8.396）明显高于单独暴露于食管癌家族史（OR＝1.874）或饮烫茶者（OR＝2.584）。
综上所述， NQO1基因C609T多态性可能是安溪县食管癌高发的危险因素之一，TT基因型是食管癌的危险基因型，其与多种环境因素之间存在交互作用，从而增强或减弱了它对食管癌的危险效应。在人群防治食管癌过程中，应考虑到易感基因与环境因素的交互作用，综合分析多种代谢酶之间的协同作用，从而有针对性地进行行为干预和化学预防，以降低食管癌的发病风险。
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