TERE1和VEGF在肾癌中的表达
【摘要】 ［目的］ 探讨肾癌中移行上皮反应基因(TERE1)和血管内皮生长因子（VEGF）的表达及意义。［方法］应用Real time RT-PCR分别检测32例肾癌及癌旁正常肾组织中TERE1和VEGF的mRNA表达水平。［结果］ 肾癌的TERE1 mRNA表达水平中位值(1.55)显著性低于癌旁正常组织(2.96），P<0.05。肾癌的VEGF mRNA表达水平中位值(43.22)显著性高于癌旁正常组织(20.35），P<0.05。TERE1与VEGF表达无显著性相关。 ［结论］ TERE1和VEGF的表达与肾癌的发生相关，监测两者指标有一定的临床意义。
【关键词】 肾肿瘤 移行上皮反应基因 血管内皮生长因子
Abstract: ［Purpose］ To investigate the expression and significance of transitional epithelial response gene (TERE1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal cell carcinoma (RCC). ［Methods］ The expression of TERE1 and VEGF mRNA and in cancer surrounding tissues was detected in 32 cases with RCC using quantitative Real-time RT-PCR assay. ［Results］ The median expression level of TERE1 mRNA was significantly lower in cancer tissues (1.55) than that in surrounding tissues (2.96), P<0.05. The median expression level of VEGF mRNA was significantly higher in the cancer tissues (43.22) than that in surrounding tissues (20.35), P<0.05. The expression of TERE1 and VEGF was not correlated significantly. ［Conclusions］ The expression of TERE1 and VEGF are correlated with carcinogenesis and with clinical significance in RCC.
Key words: renal neoplasms; transitional epithelial response gene; vascular endothelial growth factor
肾癌移行上皮反应基因(transitional epithelial response gene，TERE1)是最近发现的广泛表达于人体各种器官组织，特别是泌尿系上皮的基因[1]。有研究显示TERE1基因表达水平在膀胱浸润癌和前列腺癌中显著下降，而通过基因转染在膀胱癌和前列腺癌细胞中强制表达TERE1，提示TERE1对泌尿系肿瘤具有抑制作用[1，2]。然而TERE1在肾癌中的表达及意义尚不清楚。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 是促进恶性肿瘤进展的关键因子之一[3]。有许多研究显示VEGF在肾癌中高表达，但VEGF表达与肾癌的分期、分级以及组织分类的相关性各家报道并不一致[3~7]。我们应用Real time RT-PCR技术定量研究肾癌组织和癌旁肾组织TERE1和VEGF的表达水平及意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源
2003年1月至2005年2月在我院手术切除的肾癌标本32例，肿瘤标本取材后，同时从距肿瘤2cm以上取材外观正常的肾组织，-80℃保存。
1.2 临床资料
经病理组织学确诊的肾癌32例。男性22例，女性10例，年龄40岁～79岁，平均62.5岁。临床分期采用TNM分期：T1 15例，T2 12例，T3 5例，其中4例确诊时有转移。分级采用Fuhrman分级：G1 8例，G2 15例，G3 9例。组织分类采用1998年WHO新分类法：透明细胞癌26例，乳头状癌6例。肿瘤直径：＜4cm者15例，≥4cm者17例。
1.3 RNA抽提、鉴定及纯化
采用德国Qiagen公司的RNA提取试剂盒(Rneasy mini kit)抽提RNA，用无RNA酶的DNA酶处理技术(Rnase-Free Dnase set protocol，Qiagen公司)对总RNA进行纯化。操作按照说明书进行，用电泳法检测RNA质量。
1.4 逆转录制备cDNA
用单链cDNA合成试剂盒 (Amersham Phamacia Biotech公司，美国)将纯化的RNA(3μg)逆转录合成15μl cDNA，并按1/10稀释，-20℃保存。
1.5 引物和荧光探针的设计
应用引物设计软件 (the Primers Express software，Applied Biosystems)设计TERE1的引物和探针的序列，经GENEBANK(htt://www.ncbi.nlm.gov/BLAST)检索确定无同源序列。顺式 5′-TGCCGCTTGCCTCTACTACCT-3′，反式5′-GCCAGACAGGCCTCCAAAG-3′，Taq man探针序列为 5′-TCCCCTCTGAAACTGGAGCATTGGC-3′；VEGF 和 看家基因GAPDH 的引物与探针的序列参照[7，8]。
1.6 Real time RT-PCR定量检测靶mRNA表达水平
反应混合物包括2μL 的 1/10 稀释的cDNA, 12.5μL的混合酶缓冲液(Taq Man Universal Master Mix)，顺反式引物和Taqman探针各200nM，并加适量双蒸水至50μL。用ABI Prism5700序列检测系统(Applied Biosystems)计测PCR过程中样本的Ct值(循环数阈值)，所有样本重复检测3次。用1/20的肾癌细胞系ACHN的cDNA作为校正物，样本的靶mRNA的定量根据公式2^ -(Ct样本-Ct 校正物)(操作手册)。各样本的TERE1和VEGF的表达水平等于同一样本TERE1或VEGF mRNA定量/ GAPDH mRNA定量[7]。
1.7 统计方法
应用Wilcoxon 等级秩和检验配对比较肾癌组织和癌旁肾组织TERE1和VEGF的表达水平，并分别肾癌组织与癌旁肾组织的TERE1和VEGF的表达水平的比值(T/N)，用Mann-Whitney U 检验分析TERE1和VEGF的T/N值与肾癌病理特征的相关性。用Spearman等级相关分析TERE1和VEGF的T/N值的相关性。
2 结 果
32例肾癌和癌旁肾组织中均可检测到TERE1表达。癌组织的TERE1 mRNA水平中位值(1.55)显著低于癌旁正常组织(2.96)，P=0.005。32例中有29例肿瘤组织的表达水平低于正常组织，平均低2.93倍。TERE1的T/N比值计算结果见表1。乳头状肾癌的TERE1 T/N中位值(0.64)显著性高于透明细胞癌(0.22），P=0.031。肾癌的TERE1 T/N值与肿瘤分期、直径、分级和有无转移无显著性相关性（P＞0.05）。
32例肾癌组织和癌旁肾组织中均可检测到VEGF表达，癌组织的VEGF mRNA水平中位值(43.22)显著高于癌旁正常组织(20.35)，P=0.005，32例中有24例肿瘤组织的表达水平高于正常组织，平均高5.87倍。VEGF 的T/N比值计算结果见表1。透明细胞癌的VEGF T/N中位值(2.72)显著性高于乳头状肾癌 (0.55），P=0.005；G3级肿瘤的VEGF T/N中位值(3.06)显著性高于G1级肿瘤(0.80），P=0.015，但G2级肿瘤VEGF T/N中位值(2.48)与G1级和G3级肿瘤均无显著性差异(P>0.05)。肾癌组织的VEGF T/N值与肿瘤分期、直径和有无转移无显著相关性（P＞0.05）。
Spearman等级相关分析显示TERE1与VEGF的 T/N值无显著性相关(r=-0.23，P=0.13)。
3 讨 论
本研究结果显示TERE1在正常肾组织和肾癌组织均有表达。TERE1 基因定位于染色体1p36.3, 在微标记D1S2667 和D1S434之间，杂合性缺失(LOH)研究显示在此区域应存在着与多种肿瘤的发生和进展相关的某个或某些抑制癌基因[9]。然而在绝大多数肿瘤标本中，包括存在杂合性缺失的肿瘤，未能检测到TERE1外显子突变，这表明TERE1基因不是典型的抑癌基因[2]。研究提示TERE1的表达对肿瘤特别是泌尿系肿瘤具有抑制作用[2]。在本研究中，TERE1的表达水平在肾癌组织中较正常肾组织显著下调，32例中有29例胃癌组织中TERE1 表达水平低于其对应的癌旁肾组织，提示TERE1对肾癌也可能有抑制作用。本文显示肾透明细胞癌和乳头状肾癌在TERE1表达水平上有显著性差异。大多数肾透明细胞癌有3号染色体异常和VHL基因突变。乳头状肾癌普遍有7号、17号染色体三体性和Y染色体丢失，而无3号染色体异常和VHL基因突变，表明这两类肾癌在发生机制上存在明显差异[10]，因此，本文结果提示TERE1可能与肾癌发生相关。
关于VEGF与肾癌的分期、分级和组织分类的相关性，各家报道并不一致，特别是多数研究未能显示VEGF表达与肾癌的组织类型相关[3~6]，其原因之一可能是这些研究多采用半定量的方法。我们采用的Real time RT-PCR法是一种灵敏度和特异性均极高的定量检测特定基因mRNA表达的方法[11]，结果发现VEGF表达与分级和组织分类均无相关性。
基因芯片研究显示通过基因转染在前列腺癌细胞PC-3中强制表达TERE1，可引起多种肿瘤生长调节因子的表达水平上调或下调[2]，这提示TERE1与其他调节肿瘤生长的基因的表达相关。在本研究中，多数患者TERE1在肿瘤组织表达水平下降而VEGF的表达水平升高 ,但并未发现TERE1表达与VEGF呈显著性相关。
【】
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