散发性结直肠癌、腺瘤组织中hMLH1和突变型p53表达
作者：董崇海 曲玲 赵清喜 李杰 郭春霞 刁春艳 王德仙
【摘要】 ［目的］ 探讨hMLH1和p53基因在散发性结直肠癌发生机制中所起的作用。［方法］ 采用PV-6000二步法免疫组化检测技术对60例散发性结直肠癌，45例大肠腺瘤和26例正常大肠黏膜石蜡切片进行hMLH1和p53表达的检测。［结果］ （1）60例散发性结直肠癌hMLH1蛋白阴性表达和p53蛋白阳性表达分别为11例（18.3%）和32例（53.3%），hMLH1蛋白阴性表达和p53蛋白阳性表达与患者年龄、肿瘤部位、组织学类型和分化程度密切相关（P＜0.05或P＜0.01），而与患者性别、肿瘤大体类型、肿块大小、浸润深度、淋巴结及远处转移与否和患者的Duke’s分期均无显著相关性（P＞0.05）。（2）大肠腺瘤患者p53蛋白阳性表达与患者腺瘤部位、组织学类型和不典型增生程度密切相关（P＜0.05），而与患者性别、年龄无显著相关性（P＞0.05）。(3)散发性结直肠癌中hMLH1蛋白阴性表达组p53蛋白阳性表达率（18.2%，2/11）低于阳性表达组（61.2%，30/49）（P＜0.05）。 ［结论］ （1）大部分散发性结直肠癌是沿染色体不稳定途径发生，其中抑癌基因p53的突变起重要作用。同时，一定比例的散发性结直肠癌中存在错配修复基因的缺陷，并具有相对特殊的临床病理特征。（2）大肠腺瘤组织中有一定比例的hMLH1蛋白阴性表达和p53蛋白阳性表达，提示hMLH1和p53基因的突变可能是散发性结直肠癌发生的早期事件之一。
【关键词】 结直肠肿瘤 错配修复基因 hMLH1基因 p53基因 免疫组织化学
Expression of hMLH1 and p53 in Sporadic Colorectal Carcinoma and Colorectal Adenoma
Abstract: ［Purpose］ To explore the role of hMLH1 and p53 gene in the carcinogenesis of sporadic colorectal carcinoma. ［Methods］ The expression of hMLH1 and p53 protein in 60 cases with sporadic colorectal carcinoma, 45 cases with colorectal adenoma and 26 cases with normal intestinal mucosa were detected by PV-6000 immunohistochemical method. ［Results］ (1)Negative expression of hMLH1 protein and positive expression of p53 protein were detected in 11 cases (18.3%) and 32 cases (53.3%) with sporadic colorectal carcinoma respectively. Negative expression of hMLH1 protein and positive expression of p53 protein were closely related to patient’s age, tumor location, histological type and histological grade (P＜0.05 or P＜0.01）, but were not correlated with patient’s gender, tumor gross type, tumor size, invasive depth, lymph node metastasis, distant metastasis and Duke’s stage(P＞0.05). (2)The positive expression of p53 protein was closely related to adenoma site, histological type and dysplasia grade, but it was not correlated with patient’s gender and age(P＞0.05). (3)The positive expression of p53 protein in the group of hMLH1 protein negative expression （18.2%，2/11）was lower than that in the group of hMLH1 protein positive expression（61.2%，30/49）in sporadic colorectal carcinoma (P＜0.05）. ［Conclusions］ (1) Majority of sporadic colorectal carcinoma occurs via the chromosomal instability pathway in which the p53 gene plays an important role, meanwhile there is a subset of sporadic colorectal carcinoma displaying mismatch repair(MMR) defect with specially clinical and pathological features.(2)There is a subset of colorectal adenoma displaying negative expression of hMLH1 protein and positive expression of p53 protein. Mutation of hMLH1 gene and p53 gene may be an early event of carcinogenesis in sporadic colorectal carcinoma.
Key words: colorectal neoplasms; mismatch repair gene; hMLH1 gene; p53 gene; immunohistochemistry
结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是我国常见的恶性肿瘤之一，随着医学生物技术以及分子生物学的飞速，人们已认识到本病的发生发展是一个多基因、多阶段、多步骤渐进演化的过程。结直肠癌的发生发展并不遵循单一的途径[1]。本研究旨在将染色体不稳定途径涉及的抑癌基因p53和错配修复途径涉及的错配修复基因hMLH1结合起来，用免疫组化方法检测其在散发性结直肠癌和腺瘤组织的蛋白表达状况，分析其与临床病参数之间的关系，进而探讨p53基因与hMLH1基因在散发性结直肠癌发病机制中所起的作用。
1 材料与方法
1.1 病例选择
收集青岛大学医学院附属2004年1月～2006年5月临床资料完整的散发性结直肠癌常规石蜡包埋组织标本60例，其中男性38例，女性22例；年龄30岁~88岁，平均年龄55.65±11.36岁。结肠镜下高频电凝切除的大肠腺瘤常规石蜡包埋组织标本45例，其中男性27例，女性18例，年龄27岁~89岁，平均年龄53.89±10.66岁。正常大肠黏膜组织26例作对照。所有标本切片均经两位资深病理医师确诊。不包括家族性腺瘤性息肉病（familial adenomatous polyposis，FAP）患者和遗传性非息肉病性大肠癌(hereditary nonpolyposis colorectal cancer，HNPCC)患者。所有病例手术前均无系统的放疗和化疗病史。
1.2 免疫组织化学检测方法
1.2.1 主要试剂和工作浓度
兔抗人hMLH1多克隆抗体、鼠抗人p53单克隆抗体分别购自美国Santa Cruz公司和美国Zymed公司，工作浓度分别为1∶50和1∶100。PV-6000二步法免疫组化检测试剂购自美国Zymed公司。
1.2.2 实验方法
取存档蜡块3μｍ厚连续切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后置于新鲜配制的3%H2O2去离子水室温孵育10min，然后蒸馏水冲洗。将切片放入盛有1mM EDTA（pH8.0，1∶50）抗原修复液的容器中，置微波炉内进行微波修复：火力100×3min，火力30×7min×3，进行抗原修复。室温下冷却，PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤。滴加一抗，室温下孵育3h。PBS洗涤，滴加PV-6000二抗，置于37℃电热恒温水箱孵育20min，PBS洗涤，切片在0.04% DAB(二氨基联苯胺盐酸盐）+1%H2O2中显色，见棕黄色颗粒后终止反应。苏木精复染，盐酸酒精分化，氨水反蓝。常规脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。用PBS取代一抗作阴性对照。
1.3 判断标准
所有切片均由两位病理科资深专家阅片。每张切片选择有代表性区域，并避开切片的周边区域，光镜下随机观察10个高倍镜视野，记录10×100个阳性细胞的百分比。
阳性结果参照Friedrichs等[2]的免疫组化评判标准，分别观察染色强度和阳性细胞所占的百分数，先按染色强度计分（染色深浅需与背景着色相对比），0分为无着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再按阳性细胞所占百分比计分，0分为阴性，1分为阳性细胞≤10%，2分为阳性细胞占11%~50%，3分为阳性细胞占51%~80%，4分为阳性细胞＞80%。将染色强度与阳性细胞百分比计分的积分相乘，乘积≥2分为hMLH1和p53蛋白阳性表达，乘积0~1分为hMLH1和p53蛋白阴性表达。hMLH1阳性染色定位在黏膜上皮细胞胞浆或核染色，正常肠黏膜和淋巴细胞为内对照阳性。p53蛋白阳性染色定位在细胞核为准。
1.4 统计学处理
统计学方法应用SPSS11.5统计软件，行χ２或Fisher’s精确概率法检验。
2 结 果
2.1 hMLH1和p53蛋白表达特征
正常大肠黏膜、腺瘤及癌组织中hMLH1阴性表达率分别为0（0/26）、4.4%（2/45）和18.3%（11/60），散发性结直肠癌组与正常组、大肠腺瘤组比较均差异有显著性（P＜0.05），而大肠腺瘤组与正常组间差异无显著性（P＞0.05）。正常大肠黏膜、腺瘤和癌组织中p53蛋白阳性表达率分别为0（0/26）、20.0%（9/45）和53.3%（32/60），腺瘤和癌组织中p53蛋白阳性表达率与正常大肠黏膜比较均有显著性差异（Ｐ＜0.05），癌组织与腺瘤组织比较也有显著性差异（Ｐ＜0.01）。
2.2 hMLH1和p53蛋白表达与散发性结直肠癌临床病理学特征关系
hMLH1阴性表达和p53蛋白阳性表达与患者年龄、肿瘤部位、组织学类型和分化程度密切相关（P＜0.05或P＜0.01），而与患者性别、肿瘤大体类型、肿块大小、浸润深度、淋巴结及远处转移与否和患者的Duke’s分期均无显著性相关（P＞0.05）。见表1。
2.3 hMLH1和p53蛋白表达与腺瘤患者临床病理学特征关系
大肠腺瘤患者p53蛋白阳性表达与患者腺瘤部位、组织学类型和不典型增生程度密切相关（P＜0.05），而与患者性别、年龄无显著性相关（P＞0.05）。hMLH1阴性表达与患者临床病理学参数间均无显著性相关（P值均＞0.05）。见表2。
2.4 hMLH1与p53蛋白表达的关系
p53蛋白阳性表达的散发性结直肠癌在49例hMLH1蛋白阳性表达组有30例，占61.2%（30/49），而在11例hMLH1蛋白阴性表达组有2例，占18.2％（2/11），两组之间差异有显著性（Ｐ＜0.05）。p53蛋白阳性表达的大肠腺瘤病例在43例hMLH1蛋白阳性表达组有9例，占20.9％（9/43），而在2例hMLH1蛋白阴性表达组则为0例，两组之间差异无显著性（Ｐ＞0.05）。
3 讨 论
目前认为CRC的发生主要可以分为两种发病途径：染色体不稳定（chromosomal instability，CI）途径和错配修复（mismatch repair，MMR）途径。CI途径是结直肠癌发生的经典途径，涉及癌基因和抑癌基因的改变。其中以抑癌基因的失活作用更为重要，常伴有p53基因的突变。MMR基因保证了DNA复制的高度保真，一旦MMR基因发生突变或启动子甲基化引起错配修复基因失活，导致机体错配修复功能的降低，进而导致整个基因组的不稳定，从而使某些癌基因和抑癌基因的突变在体内得到快速聚集，肿瘤由此发生[3]。MMR功能缺陷的表现型是高度的微卫星不稳定（high level microsatellite instability，MSI-H），又称之为复制错误（repliation error，RER）阳性，在此途径中，hMLH1和hMSH2这两个MMR基因起主要作用[4~7]。
近年研究发现，hMLH1蛋白的表达变化结果可以很好地预示MMR功能缺陷的存在[8]。本研究结果显示，在60例散发性CRC病例中，有11例hMLH1阴性表达，占18.3%（11/60），发现在一定比例的散发性CRC中存在着MMR基因功能缺陷，此结果与Chiaraualli等[9]的研究结果基本一致。本研究结果还显示hMLH1阴性表达与患者的年龄（≤40岁）、肿瘤的部位（近端结肠）、组织学类型（黏液腺癌）和分化程度（低分化）关系密切（P＜0.05）。另外，研究结果显示在一定比例的大肠腺瘤组织中也有hMLH1阴性表达(4.4%)，但统计学分析hMLH1阴性表达与患者年龄、性别、腺瘤部位、组织学类型和不典型增生程度间均无显著性差异（P＞0.05），考虑与所研究病例例数过少有关。提示在腺瘤阶段已经有MMR基因的突变或功能异常，hMLH1基因的突变可能是结直肠癌发生的早期事件之一。目前认为RER阳性散发性CRC主要是由于hMLH1基因启动子甲基化导致hMLH1基因的转录和翻译的静默而出现蛋白的表达缺失与MSI引起[10，11]。
p53基因与结直肠癌关系备受关注。p53基因分为野生型（wt-p53）和突变型（mt-p53），野生型p53基因是极为重要的肿瘤抑制基因[12]。正常细胞中，wt-p53基因蛋白含量很少，并且半衰期仅为20min左右，难以通过常规免疫组化方法检测到；而mt-p53基因蛋白由于其构象改变且能与一些癌蛋白结合形成复合物，其稳定性增加，半衰期延长，可达2h~12h，细胞内聚集量比正常细胞高出100~1000倍左右。因此，可用免疫组化方法检测出来。一些研究已经证实p53基因突变与p53蛋白的过度表达呈良好的相关性[13]。本研究结果显示，60例散发性CRC病例中，有32例p53蛋白表达阳性，占53.3%（32/60），且p53蛋白阳性表达与患者年龄（＞40岁）、肿瘤部位（远端结肠/直肠）、组织学类型（腺癌）和分化程度（中—低分化腺癌）关系密切（P＜0.05）。研究结果还显示，腺瘤组织中有相当比例的p53蛋白阳性表达（9/45，20%），统计学处理表明腺瘤组织中p53蛋白阳性表达与腺瘤部位（远端结肠/直肠）、组织学类型（绒毛状腺瘤）和不典型增生程度（重度）密切相关。随着不典型增生程度的加重而p53蛋白阳性率逐渐升高，提示p53基因突变主要发生在腺瘤—癌序列的晚期，是结直肠癌发生的早期事件。p53蛋白阳性表达率在远端结肠腺瘤组织比在近端结肠高，推测可能与左右结肠来自不同的胚层，受基因调控作用不同有关。我们认为检测p53蛋白表达状况有利于预测腺瘤癌变倾向。
运用免疫组化技术检测hMLH1和突变型p53基因的蛋白表达，方法简便、快速有效，可应用于临床实践的指导，对临床识别不同发病机制导致的散发性CRC具有重要价值。随着研究的深入，对方案的制定和患者的远期预后情况的预测可能有重要的临床应用价值。
【】
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