胃癌中缺氧诱导因子-1α表达及其与VDGF的关系
【摘要】 ［目的］ 探讨胃癌组织中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达及其与血管内皮生长因子（VEGF）的关系。［方法］ 用免疫组织化学SP法检测80例胃癌中HIF-1α、VEGF的表达，并与 30例胃癌旁不典型增生组织、30例胃正常组织作为对照；分析HIF-1α、VEGF与胃癌临床病理因素及预后的关系。［结果］ HIF-1α和VEGF在胃癌中的阳性表达分别为47.5％(38/80)和71.3％(57/80)，明显高于胃癌旁不典型组织及胃正常组织(P＜0.05）。HIF-1α、VEGF与胃癌的TNM 分期以及肿瘤浸润深度、淋巴结转移等相关(P＜0.05），与组织学分级无关。胃癌中HIF-1α与VEGF的表达呈显著性正相关(r=0.328，P＜0.01）。［结论］ HIF-1α、VEGF均在胃癌中过表达并且与胃癌的侵袭、转移及预后密切相关，HIF-1α可能通过上调VEGF的表达，在胃癌的发生、中发挥重要作用。
【关键词】 胃肿瘤 缺氧诱导因子-1α 血管内皮生长因子 免疫组化
Expression of Hypoxia Inducible Factor-1α in Gastric Carcinoma and its Relationship with Vascular Endothelial Growth Factor
许多研究已证实，肿瘤的生长、浸润和转移与血管生成有非常密切的关系。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是在缺氧诱导下肿瘤细胞产生的一种核转录因子，可调节包括血管内皮生长因子(VEGF)在内的众多靶基因的表达，进而在许多肿瘤的恶性生长过程中发挥着重要的作用[1]。VEGF则是诱导肿瘤血管生长最关键的因子。我们采用免疫组织化学技术检测HIF-1α、VEGF在80例胃癌中的表达，探讨它们在胃癌发生、发展中的作用以及两者之间的相关性。
1.1 材 料
选取1995~2000年间我院经手术切除的具有完整临床资料和病理资料的胃癌石蜡标本80例。男性44例，女性36例，年龄52.5±3.32岁(33~76岁)。所有切片按全国胃癌协作组标准复检确定。组织学分级：高中分化组36例、低分化组44例。浸润深度：癌组织侵及黏膜及黏膜下12例，侵及肌层32例，侵及浆膜和浆膜外36例。80例中62例伴有淋巴结转移。TNM 分期：Ⅰ期 14例，Ⅱ期18例，Ⅲ期 38例，Ⅳ期10例。所有患者术前均未行任何抗肿瘤。另取30例胃癌旁不典型增生组织（距肿瘤边缘1~2cm）及30例胃正常组织（手术切端，病理证实无癌细胞残留）作为对照组。
1.2 方 法
标本经常规固定及脱水包埋，作 4μm厚连续切片，分别进行 HE染色和免疫组织化学染色。鼠抗人HIF-1α多克隆抗体(浓缩型BA0912)为美国NEO MARKERS公司产品，工作浓度1∶100。鼠抗人单抗VEGF（即用型 JH121）试剂及SP试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。PBS代替一抗作为阴性对照片。阳性对照片由试剂公司提供。具体操作步骤严格按照说明书进行。
1.3 结果判断
HIF-1α按照Zhong等[2]的方法，以细胞核或细胞质内呈棕黄色为阳性，高倍镜下(400倍)对每张切片随机选择5个视野，每个视野计数200个细胞，共计10 000个。0分：无着色；1分：<1%细胞核着色；2分：1%～10%细胞核着色和（或）胞质弱着色；3分：10%～50%细胞核着色和（或）胞质明显着色；4分：>50%细胞核着色和（或）胞质强着色。评分结果：0～1分定为阴性，2～4分定为阳性。而VEGF参照Cascinu等[3]的方法，以细胞质内呈棕黄色为阳性，先在低倍镜下（×40）选择3个视野，然后每个视野中选5个高倍视野（×200）观察，计数100个细胞，阳性细胞数<10%为阴性，>10%为阳性。
1.4 统计学处理
实验数据百分率比较采用χ2检验，生存率采用Kaplan-Meier法，并绘制生存曲线，生存期差异的比较及Kaplan-Meier生存曲线采用 Logrank 检验，HIF-1α与VEGF表达的相关性分析采用Spearman’s Rank Correlation检验，所有结果均以P＜0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 HIF-1α和VEGF在胃癌组织中的表达
HIF-1α表达部位主要在细胞核。部分癌细胞有HIF-1α表达，强染色细胞主要见于浸润边缘的癌组织。VEGF表达部位主要在肿瘤细胞细胞质中, 细胞核亦可见VEGF表达。见图1、2。
2.2 HIF-1α和VEGF在不同胃黏膜组织中的表达
由表1可知，HIF-1α和VEGF在胃癌中的表达明显高于胃癌旁非典型增生组织及胃正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 HIF-1α和VEGF与胃癌临床病理因素的关系
HIF-1α、VEGF与胃癌的TNM 分期以及肿瘤浸润深度、淋巴结转移等恶性行为明显相关，与组织学分级无关（见表2）。
2.4 HIF-1α、VEGF在胃癌组织中表达的相关关系
80例胃癌组织中HIF-1α与VEGF表达双阳性33例，双阴性18例，HIF-1α表达阳性而VEGF阴性5例，HIF-1α表达阴性而VEGF阳性24例。胃癌中HIF-1α与VEGF的表达呈显著性正相关（相关系数r=0.328，P＜0.01）。
2.5 HIF-1α、VEGF表达与胃癌术后生存率的关系
在有完整随访资料的67例胃癌中，HIF-1α阳性者的平均生存期（33.3个月）、5年生存率（15.2%）、4年生存率（18.2%）、3年生存率（30.3%）均显著性低于HIF-1α阴性者的平均生存期（61.0个月）、5年生存率（50.0%）、4年生存率（55.9%）、3年生存率（64.7%）（P＜0.01）。生存曲线见图3。同时，VEGF阳性者的平均生存期（39.96个月）、5年生存率（22.9%）、4年生存率（27.08%）、3年生存率（39.58%）亦都显著性低于VEGF阴性者的平均生存期（66.05个月）、5年生存率（57.89%）、4年生存率（63.16%）、3年生存率（68.42%）（P＜0.01）。提示HIF-1α、VEGF的表达与胃癌的预后显著相关。
3 讨 论
在实体瘤的恶性增殖过程中，普遍存在缺血缺氧的现象，但肿瘤细胞不仅能够调节适应，而且可以侵袭进展，在这一过程中缺氧诱导因子-1可能起到关键作用。HIF是近年在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的一种异源二聚体转录因子，由α和β两个亚基组成。HIF-1α为O2调节单位，它决定HIF-1的活性。在缺氧状态下，HIF-1α蛋白水平提高并转移至细胞核内与HIF-1β结合形成有活性的HIF-1，启动下游靶基因如VEGF、葡萄糖载体-1、糖酵解酶、红细胞生成素等，对肿瘤的血管生成、能量代谢、激素代谢等方面产生重要作用，进而促使恶性肿瘤的增殖、浸润和转移。Talks等[4]发现大多数恶性肿瘤细胞中有HIF-1α表达，且HIF-1α在肿瘤坏死明显的区域和肿瘤浸润的边缘表达明显增多。本实验在胃癌细胞中观察到同样的现象，这提示HIF-1α受缺氧水平的调控。另外，HIF-1α在胃癌中的阳性表达率为47.5%，在胃癌旁不典型增生组织为20%，而在胃正常组织中的阳性表达率为0，HIF-1α的表达率按正常黏膜—增生—癌的次序递增，这一结果提示HIF-1α可能在胃癌的发生过程中起一定作用。本组研究还显示胃癌中HIF-1α的阳性表达与胃癌的肿瘤浸润深度、淋巴结转移以及TNM分期等恶性行为明显相关，而这三项恰恰是决定胃癌预后的重要指标，提示HIF-1α过表达可能在胃癌的进展转移过程中起到重要作用，是胃癌预后不良的一个标志，这与罗明华等[5]的研究结果相同。本组资料的预后分析显示，HIF-1α表达阳性组的平均生存期与3年、4年、5年生存率均显著低于HIF-1α阴性者，进一步证实了这一结果。
肿瘤适应缺氧的重要途径之一是新生血管的形成，而肿瘤新生血管形成与实体瘤的发生、侵袭和转移密切相关，并影响大部分恶性肿瘤的预后。许多研究已表明，血管内皮生长因子(VEGF)是诱导肿瘤产生新生血管最主要的细胞因子，它通过内皮细胞的特异性受体刺激血管内皮细胞增殖和毛细血管形成，并增加微血管通透性，促使肿瘤浸润、转移，可以作为反映胃癌预后的一项独立指标[6]。本实验结果显示，胃癌中VEGF的阳性表达率显著高于癌旁胃组织组和胃正常组织组，且随着肿瘤浸润深度的加深、淋巴结转移以及TNM 分期的增加，其阳性表达率逐渐升高，说明VEGF的高表达与胃癌的恶性行为及不良预后密切相关。同样，本组胃癌术后生存期与生存率分析进一步证实了这一点。
VEGF作为促进肿瘤新生血管形成的重要血管生长因子，其激活因子包括癌基因H-ras、K-ras的突变，p53基因的失活，雌激素和黄体酮，转化生长因子等。但核转录因子HIF-1α可能是VEGF最为关键的激活因子[7]。大多数实体瘤随着肿瘤的不断生长、体积增大必将发生血供不足而导致缺氧坏死，进而诱导HIF-1α过度表达，由于VEGF启动子中存在缺氧反应元件共同序列，HIF-1α在肿瘤中通过激活VEGF基因并增强其表达，从而激活一系列的缺血传导通路，诱导新生血管的生成，促进了恶性肿瘤的生长、浸润和转移。另外，有研究还发现VEGF是肿瘤缺氧状态下血管生长的最主要因子[8]。Burchler等[9]报道在缺氧状态下，胰腺癌细胞株都有VEGF的过量表达，而且高表达HIF-1α蛋白的细胞株可产生高水平的VEGF。本研究结果也显示，在胃癌中HIF-1α和VEGF的阳性表达具有明显的相关性。
因此，结合上述HIF-1α和VEGF在胃癌中的阳性表达与临床病理因素及生存期的相关性，我们认为，联合检测HIF-1α和VEGF在胃癌组织中的表达，可以提高预测胃癌预后的可靠性。同时，由于胃癌组织中VEGF过表达与HIF-1α的活化有关，通过降低HIF-1α的活性以抑制VEGF表达，从而抑制肿瘤生长和转移，可能成为恶性肿瘤抗血管生成的一条新的途径。
【】
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